猪肠激酶催化亚基基因的克隆及其在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达

摘要

肠激酶(Enterokinause,EK)是哺乳动物十二指肠上皮产生的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶,由1条重链和1条轻链组成,酶的催化活性部位于轻链上。EK是蛋白酶类中专一性较高的一种酶,它能够专一性识别蛋白质分子中由连续4个天冬氨酸和1个赖氨酸与下一个任意氨基酸组成的肽段,并能水解由赖氨酸与任意氨基酸形成的肽键,即.D-D-D-D-K-↓-X-(X代表任意氨基酸)。用EK切割融合蛋白不仅能够确保其它部位的肽键不被破坏,同时切割后所释放的目的多肽具有和野生型完全一致的N-末端氨基酸序列,因此EK作为蛋白表达体系中融合蛋白的切割试剂被广泛利用。市售的肠激酶价格昂贵,本实验拟采用基因工程的方法制备具有生物活性的肠激酶。目前,多见关于牛肠激酶的研究,对猪肠激酶的的研究未见于报道。因此,本试验考虑到生产成本和重组蛋白活性等方面,对猪的肠激酶轻链分别采用毕赤酵母表达体系和原核表达体系进行了表达。
　　 本研究对猪肠激酶催化亚基基因进行了克隆并在毕赤酵母中进行了表达。为制备重组猪肠激酶催化亚基(EKL),依据GenBank猪EKL基因的编码序列,通过RT-PCR方法从猪小肠粘膜组织中扩增EKL cDNA基因,利用SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点,将该EKL片段插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K质粒中,并与载体中的α因子信号肽序列融合,构建成EKL基因的分泌型酵母表达载体pPIC9K-EKL。表达载体经SalⅠ线性化后,以电转化的方法将其转移到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中。然后利用以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mm+)酵母重组体,再经G418加压筛选得到高拷贝猪EKL基因的重组酵母。经PCR检测证明EKL基因已整合到毕赤酵母的染色体中。重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导进行表达,表达产物经SDS-PAGE检测及酶促活性检测,结果显示在酵母菌培养基中检测到分子量为35 kDa的重组EKL蛋白,经过对制备的胰蛋白酶原进行酶促水解检测,证明该重组EKL蛋白具有激活胰蛋白酶原的活性,表明本研究制备的重组猪EKL具有生物活性。考虑到生产成本及表达便捷程度等方面的因素,本试验用大肠杆菌BL21(DE3)对猪肠激酶催化亚基基因进行了表达。采用PCR方法扩增猪肠激酶轻链(EKL)基因,利用EcoRⅤ和HindⅢ位点将猪EKL基因插入到原核表达载体pET-20b(+)中,构建成C端与His-tag融合的EKL原核表达载体pET-20b-EKL。将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导,使猪EKL基因在大肠杆菌中进行表达,表达菌体经超声波破碎、离心后用SDS-PAGE和Western blot检测上清中的表达重组猪EKL。结果表明构建的猪EKL原核载体能够介导重组猪EKL在大肠杆菌中表达。表达重组EKL能够特异切开含有肠激酶切点的融合蛋白,这表明本试验用大肠杆菌表达系统制备的重组猪EKL也具有生物活性。这项研究为重组猪EKL在科学研究和生产中的应用奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

缩略词索引表

1 前言

1.1 肠激酶的研究进展

1.1.1 肠激酶的特点

1.1.2 肠激酶的酶学特点

1.1.3 肠激酶的基因工程研究进展

1.2 研究目的及意义

2.实验一、猪肠激酶催化亚基基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果

2.2.1 猪EKL基因的扩增与克隆

2.2.2 重组质粒pMD18-T-EKL的鉴定

2.2.3 重组质粒pPIC9K-EKL的构建及酶切鉴定

2.2.4 EKL基因酵母工程菌的构建

2.2.5 重组猪肠激酶的甲醇诱导表达

2.2.6 重组猪肠激酶的活性分析

2.3 讨论

3.实验二、猪肠激酶催化亚基基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果

3.2.1 猪EKL基因的扩增

3.2.2 重组pET-20b-EKL质粒的构建及酶切鉴定

3.2.3 重组猪肠激酶的诱导表达及Western blot鉴定

3.2.4 重组猪肠激酶的酶活性鉴定

3.3 讨论

4 结论

参考文献

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致谢

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