甲基营养菌Methylobacterium sp.MB200与类胡萝卜素合成相关基因的克隆及研究

摘要

甲基营养菌被定为能够利用含一个或多个碳原子但不含C-C键的低碳化合物(如甲醇、甲胺等)为唯一碳源和能源进行生长的一类微生物，利用其特殊的代谢途径，可以进行单细胞蛋白、氨基酸、类胡萝卜素等的生产，因此研究该类细菌的合成代谢途径无论从理论还是实际应用上都具有显著的意义。
　　 实验以甲基营养菌M.sp.MB200为原始菌株，首先采用转座子突变技术和三亲本接合方法构建了M.sp.MB200的部分突变体库，库容量为11552株，通过表型颜色变化从部分突变体库中筛选得到33株颜色发生变化的目的突变体，随后利用分子克隆技术对目的突变体的突变基因进行克隆，共得到8个基因，分别对这8个基因进行了生物信息学分析，发现有三个基因与类胡萝卜素合成途径密切相关，分别为GGPP合成酶基因、crtB基因和crtⅠ基因。其中，GGPP合成酶的功能可能为催化从法尼基焦磷酸(FPP)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)，CrtB的功能则是催化从GGPP合成八氢番茄红素，CrtⅠ的功能体现在八氢番茄红素的脱氢过程中，有两种选择，第一种选择是催化八氢番茄红素经过四次脱氢合成红色的番茄红素，第二种选择是催化八氢番茄红素经过三次脱氢合成黄色的链孢红素，因此在类胡萝卜素生物合成途径的选择中扮演着重要的角色。鉴于CrtⅠ的这种特殊功能，本实验选择crtⅠ基因作为进一步研究的对象，生物信息学分析发现，从目的突变体MBW31中克隆得到的crtⅠ基因，全长为1539 bp，编码512个氨基酸，与来自M.populi BJ001、M.chloromethanicum CM4和M。extorquens AM1的crtⅠ基因在核苷酸水平上一致性均为93%。与来自M。extorquens PA1、M.chloromethanicum CM4和M.populi BJ001的CrtⅠ在氨基酸水平上相似性均为96%。
　　 实验进一步将crtⅠ基因与载体pCM80连接得到重组质粒pCM80-crtⅠ，通过三亲本接合方法导入原始菌株中构建了重组菌MB200/pCM80-crtⅠ。测定原始菌株与重组菌株的CrtⅠ酶活，结果发现，重组菌株CrtⅠ的酶活与原始菌株相比约提高了42%。另外，通过对提取的类胡萝卜素进行分光光度法检测和高效液相色谱法检测，发现其产物中并没有番茄红素的产生，由此推测CrtⅠ在M.sp.MB200的类胡萝卜素合成途径中扮演的角色可能是催化八氢番茄红素经过三次脱氢合成黄色的链孢红素，而不是催化八氢番茄红素经过四次脱氢形成红色的番茄红素。实验结果为完善甲基营养菌中类胡萝卜素的生物合成代谢途径提供了理论参考和依据。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1.1 甲基营养菌简介

1.2 类胡萝卜素

1.3 质粒转座子pTnMod-RKm'简介

1.4 本课题的研究目的及意义

1.5 技术路线

第二章 实验材料和方法

2.1 本实验所用菌株及质粒

2.2 培养基和抗生素

2.3 实验所用试剂

2.4 实验用缓冲液及溶液

2.5 菌株培养及保存

2.6 突变体库的构建和目的突变体的筛选分析

2.7 目的突变体基因的克隆及分析

2.8 甲基营养菌基因组DNA的提取

2.9 质粒DNA的提取

2.10 琼脂糖凝胶电泳

2.11 DNA的限制性酶切及纯化、连接

2.12 转化

2.13 重组菌株MB200/pCM80-crtI的构建

2.14 重组菌株MB200/pCM80-crtI的分析

2.15 重组菌株MB200/pCM80-crtI中CrtI酶活测定

2.16 色素的提取和鉴定

第三章 结果与分析

3.1 突变体库的构建和目的突变体的筛选分析

3.2 目的突变体基因的克隆及分析

3.3 重组菌株MB200/pCM80-crtI的构建

3.4 重组菌株MB200/pCM80-crtI生长情况分析

3.5 重组菌株MB200/pCM80-crtI甲醇利用能力分析

3.6 重组菌株MB200/pCM80-crtI中CrtI酶活的测定

3.7 色素的提取和检测

第四章 总结与讨论

4.1 总结

4.2 讨论

参考文献

附录一 实验所用引物

附录二 试验用仪器和设备

致谢

攻读学位期间发表的学术论文