猪瘟病毒Erns、NS4A、NS4B、NS5A蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

摘要

猪瘟分布于是世界各地，在国内广泛流行，给养猪业造成严重的经济损失。长期的疫苗使用，造成病毒发生变异，呈现多种病型的发生。猪瘟病毒建立了一种逃避宿主先天性免疫系统识别的策略，免疫系统不能识别非自我元件而导致免疫耐受，造成猪的持续性感染。猪瘟病毒Erns蛋白能诱导产生中和抗体，在病毒的持续性感染和抗病毒应答过程中发挥重要功能作用，NS4A、NS4B、NS5A参与病毒RNA的复制过程，四种蛋白Erns、NS4A、NS4B和NS5A在对宿主的致病过程中扮演着重要角色，研制猪瘟病毒各种蛋白的抗体有助于对病毒蛋白的结构与功能的深入探讨，因此本研究通过制备结构蛋白Erns和非结构蛋白NS4A、NS4B和NS5A的多克隆抗体，进一步探索感染细胞中猪瘟病毒Erns、NS4A、NS4B、NS5A蛋白与宿主的相互作用关系。
　　 本文克隆了Erns、NS4A、NS4B△205-347、NS5A基因，将这些基因插入原核表达载体PET-32a(+)克隆位点，成功构建了PET-Erns、PET-NS4A、PET-NS4B△205-347、PET-NS5A重组原核表达质粒。将重组质粒转化BL-21或BL-21衍生菌并进行IPTG诱导表达，经SDS-PAGE和Westeen Blot分析显示Erns、NS4A、NS4B△205-347和NS5A基因得到了有效表达，Erns、NS4A、NS5A重组蛋白主要以包涵体的形式表达，而NS4B△205-347重组蛋白能以包涵体和可溶性蛋白两种形式进行表达。Erns、NS4A、NS5A包涵体在变性条件下，通过Ni2+的亲和层析法纯化蛋白，纯化的蛋白经逐步透析法进行复性重折叠，获得有活性的免疫原。NS4B△205-347可溶性蛋白不需经变性就可经Ni2+的亲和层析纯化获得有活性的蛋白。以制备的Erns、NS4A、NS4B△205-347、NS5B重组活性蛋白作为抗原按免疫程序免疫四周龄小鼠，获取抗这四种蛋白的多克隆抗体。Western Blot分析显示:抗Erns、NS4A、NS4B△205-347和NS5A重组蛋白的多克隆抗体能分别与相应的重组蛋白发生良好反应;PK-15细胞中真核表达融合GFP蛋白的NS4B蛋白，抗NS4B△205-347的多克隆抗体能特异地识别NS4B-GFP融合蛋白;抗NS5A蛋白的多克隆抗体能与PK-15细胞真核表达的NS5A-GFP融合蛋白特异性结合;NS4A、NS5A多抗能分别特异性地检测到CSFV感染PK-15细胞中的NS4A、NS5A蛋白。对感染CSFV的PK-15细胞的间接免疫荧光抗体试验显示:抗Erns、NS4A、NS4B△205-347、NS5A重组蛋白的抗体能分别与CSFV的Erns、NS4A、NS4B、NS5A蛋白发生反应，具备良好的敏感性与特异性，同时也表明这些抗体能检测到CSFV的Erns、NS4A、NS4B、NS5A亚细胞定位于PK-15细胞胞质中。

目录

声明

摘要

英文缩写对照表

第一章 文献综述

1．1 猪瘟病毒的分类及其结构特性

1．2 猪瘟病毒的致病机理研究

1．2．1 免疫抑制

1．2．2 免疫逃避

1．2．3 出血机制

1．3 猪瘟病毒基因组结构及其功能蛋白的特性

1．3．1 CSFV的非编码区

1．3．2 CSFV的非结构蛋白

1．3．3 CSFV的结构蛋白

1．4 非结构蛋白NS4A、NS4B和NS5A及结构蛋白Erns的研究进展

1．4．1 NS4A蛋白

1．4．2 NS4B蛋白

1．4．3 NS5A蛋白

1．4．5 Erns蛋白

1．5 本研究的目的与意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 病毒、细胞、质粒与菌株

2．1．2 试验动物

2．1．3 引物及载体构建策略

2．1．4 实验仪器

2．1．5 试剂

2．1．6 试剂配制

2．1．7 感受态细胞的制备

2．2 技术路线

2．3 试验方法

2．3．1 基因的克隆

2．3．2 构建原核表达载体

2．3．3 重组蛋白的诱导表达

2．3．4 纯化重组蛋白

2．3．5 免疫小白鼠制备多抗血清

2．3．6 多克隆抗体的特异性

第三章 实验结果

3．1 总体实验设计及所用引物

3．2 猪瘟病毒Erns蛋白的原核表达及多抗的制备

3．2．1 Erns表达区域的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列

3．2．2 猪瘟病毒Erns基因的克隆

3．2．3 构建Erns基因的原核表达载体

3．2．4 Erns重组蛋白的诱导表达

3．2．5 Erns重组蛋白表达形式的鉴定与纯化

3．2．5 Western Blot鉴定Erns重组蛋白

3．2．6 抗Erns多克隆抗体与纯化的重组蛋白的反应性

3．2．7 抗Erns多克隆抗体与CSFV感染PK-15细胞中Erns蛋白的反应性

3．3 猪瘟病毒NS4A蛋白的原核表达及多抗的制备

3．3．1 NS4A表达区域的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列

3．3．2 猪瘟病毒NS4A基因的克隆

3．3．3 构建NS4A基因的原核表达载体

3．3．4 原核表达载体PET-NS4A的诱导表达

3．3．5 NS4A重组蛋白表达形式的鉴定与纯化

3．3．6 Western Blot鉴定NS4A重组蛋白

3．3．7 抗NS4A多克隆抗体与NS4A重组蛋白的反应性

3．3．8 抗NS4A多克隆抗体与CSFV感染的PK-15细胞中NS4A蛋白的反应性

3．4 猪瘟病毒NS4B蛋白的原核表达及多抗的制备

3．4．1 NS4B表达区域的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分析

3．4．2 猪瘟病毒NS4B基因的克隆

3．4．3 构建NS4B基因的原核表达载体

3．4．4 诱导NS4B基因原核表达载体表达蛋白

3．4．5 NS4B△205-347重组蛋白的纯化及鉴定

3．4．6 Western Blot鉴定NS4B△205-347重组蛋白

3．4．7 抗NS4B△205-347多克隆抗体与重组蛋白的反应性

3．4．8 抗NS4B△205-347多克隆抗体与真核表达NS4B蛋白的反应性

3．4．9 抗NS4B△205-347多克隆抗体与CSFV感染PK-15细胞中NS4B蛋白的反应性

3．5 猪瘟病毒NS5A蛋白的原核表达及多抗的制备

3．5．1 NS5A表达区域的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列

3．5．2 猪瘟病毒NS5A基因的克隆

3．5．3 构建NS5A基因的原核表达载体

3．5．4 原核表达载体PET-NS5A的诱导表达

3．5．5 NS5A蛋白表达形式的鉴定及纯化

3．5．6 NS5A重组蛋白的Western Blot分析

3．5．7 抗NS5A多克隆抗体与重组蛋白的反应性

3．5．8 抗NS5A多克隆抗体与PK-15细胞中真核表达的NS5A蛋白的反应性

3．5．9 抗NS5A多克隆抗体与CSFV感染PK-15细胞中NS5A蛋白的反应性

第四章 讨论

4．1 免疫原的选择

4．2 猪瘟病毒Erns、NS4A、NS4B、NS5A的原核表达策略

4．3 可溶性抗原的制备

4．4 多克隆抗体的反应性和特异性

第五章 总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况