组蛋白H3S10磷酸化在动物卵母细胞成熟及核移植胚胎发育过程中的作用研究

摘要

本研究主要探讨动物卵母细胞成熟及核移植胚胎发育过程中的组蛋白磷酸化表达规律，以便了解组蛋白磷酸化在早期胚胎发育过程中的作用及其与组蛋白乙酰化之间的关系，为通过表观遗传学调控提高胚胎发育能力奠定基础。本研究主要内容包括：
　　 ⑴以体外成熟兔、猪卵母细胞为材料，采用免疫荧光标记方法检测兔、猪卵母细胞不同成熟时期组蛋白H3第10位丝氨酸(H3S10)磷酸化的动态分布，同时探讨不同浓度ZM447439及不同浓度TSA处理卵母细胞对组蛋白H3S10磷酸化的影响。结果发现，兔、猪卵母细胞组蛋白H3S10磷酸化GV期几乎不表达，GVBD期均开始表达，但两者成熟各阶段表达规律不同。兔卵母细胞GVBD期磷酸化水平最高，MⅠ期降低，AⅠ期及MⅡ期呈上升趋势，但均比GVBD期低。而猪卵母细胞GVBD至AⅠ期，磷酸化水平呈上升趋势，MⅠ或AⅠ期最高，至MⅡ期，磷酸化水平降低。不同浓度ZM447439处理卵母细胞对组蛋白H3S10磷酸化表达影响的研究结果显示，低浓度ZM447439对兔、猪卵母细胞核成熟进程影响都不大，但当其浓度增加到30μM时，基本不能到达MⅠ期。当ZM447439浓度为5μM时，少部分兔，猪卵母细胞(20.7％ vs10.9％) H3S10去磷酸化，其他卵母细胞H3S10磷酸化信号与未处理组相似;ZM447439浓度为10μM时，45.8％的兔、35.2％的猪卵母细胞H3S10发生去磷酸化;ZM447439浓度为30μM时，大多数兔、猪卵母细胞中的H3S10磷酸化消失。不同浓度TSA处理卵母细胞对组蛋白H3S10磷酸化影响的研究结果显示，TSA浓度为10nM时，89.5％的猪卵母细胞H3S10发生磷酸化，与对照组差异不显著(p＞0.05); TSA浓度为50 nM时，2.3％的猪卵母细胞H3S10磷酸化。
　　 ⑵探讨了猪早期胚胎发育过程中组蛋白H3S10磷酸化的分布与表达情况。不同浓度TSA对猪4-细胞核移植胚胎发育有丝分裂前、中、后期磷酸化表达影响的研究结果发现，细胞分裂前期H3S10发生磷酸化，在分裂中期达到高峰，分裂末期随着整体磷酸化水平的下降而下降。核移植胚胎有丝分裂各时期磷酸化水平显著高于PA组及TSA处理组胚胎(p＜0.05)。猪早期胚胎发育各阶段有丝分裂中期组蛋白H3S10磷酸化表达情况的研究结果显示，猪核移植胚胎从2-细胞到囊胚期，组蛋白H3S10磷酸化表达是呈先降低后升高的趋势，且猪核移植胚胎发育各阶段有丝分裂中期组蛋白H3S10磷酸化水平显著高于孤雌组及TSA处理组胚胎(p＜0.05)。不同浓度TSA对猪核移植胚胎与组蛋白H3磷酸化相关基因AURKB及乙酰化相关基因HDAC2表达影响的实时荧光定量PCR检测结果显示，与孤雌及核移植胚胎相比，TSA处理的核移植胚胎在2-细胞、4-细胞及囊胚阶段，AURKB、HDAC2基因的表达量均显著降低(p＜0.05)，且随着胚胎发育均呈现逐渐降低的趋势，表明TSA处理能显著降低核移植胚胎AURKB及HDAC2基因的表达。
　　 ⑶上述结果表明：哺乳动物卵母细胞减数分裂过程中组蛋白H3S10磷酸化的动态变化对卵母细胞成熟具有一定作用；高剂量的靶向抗肿瘤药物AuroraB激酶抑制剂ZM447439对哺乳动物生殖细胞成熟发育具有损害作用；卵母细胞体外成熟过程中，Aurora-B激酶、组蛋白H3S10磷酸化及染色体动态变化之间存在密切的正相关关系；组蛋白H3去乙酰化可能是卵母细胞成熟（减数分裂）过程中组蛋白H3磷酸化所必须的；TSA能显著降低核移植胚胎组蛋白H3S10磷酸化水平，并显著降低AURKB及HDAC2基因的表达；SCNT胚胎发育过程中，组蛋白H3S10磷酸化与组蛋白去乙酰化之间可能存在正相关关系。

目录

声明

摘要

附录

第一部分 文献综述

第一章 表观遗传修饰概述

1 表观遗传修饰研究简介

2 表观遗传修饰的分类及功能

3 表观遗传修饰的作用机制

第二章 组蛋白H3磷酸化研究进展

1 组蛋白H3磷酸化与染色质重塑

2 组蛋白H3磷酸化与组蛋白H3去乙酰化

3 调节组蛋白H3磷酸化的酶类

第三章 体细胞核移植相关研究进展

1 组蛋白修饰基础上核移植技术的改善

2 组蛋白去乙酰化酶抑制剂提高重编程的机制

3 HDACi处理克隆胚胎对基因重编程的影响

研究目的与意义

第二部分 试验部分

第一章 卵母细胞成熟过程中组蛋白H3S10磷酸化的表达规律

1 试验材料与方法

2 实验结果

3 分析与讨论

4 结论

第二章 SCNT胚胎发育过程中组蛋白H3S10磷酸化的表达规律

1 试验材料与方法

2 实验结果

3 分析与讨论

4 结论

图片与说明

参考文献

致谢

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