H3N2和H1N1亚型猪流感病毒的遗传进化分析

摘要

猪流感(Swine influenza,SI),是由甲型猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引发的一种急性接触传染性呼吸道疾病,临床表现为突发咳嗽、呼吸困难、发热、不同年龄、品种和性别的猪均能感染,是当今规模化猪场普遍存在且难以根治的群发性疾病。2012年8月份至2014年3月份,实验室通过对收集至全区各地的猪流感(Swine influenza,SI)的疑似样品进行阳性鉴定,应用鸡胚接种和细胞培养的方法分离出5株SIV,本研究主要通过对这分离得到的5株猪流感病毒分别进行8个片段的全基因扩增后进行NCBI-BLAST比对,结果显示5株分离株分别为2株H3N2亚型和3株 H1N1亚型的SIV。这5株分离株分别命名为A/swine/Guangxi/NN01/2013(H3N2)(简称 NN01株)、A/swine/Guangxi/JG04/2013(H3N2)(简称JG04株)、A/Guangxi/DX24/2
　　013/DX24/2013(H1N1)(简称DX24株),A/swine/Guangxi/DX31/2013(H1N1)(简称DX31株)以及A/swine/Guangxi/BB2/2013(H1N1)(简称BB2株)。
　　根据构建基因遗传进化树以及核苷酸同源性的分析结果显示,NN01株的HA基因位于人源 H3N2季节性流感分支,同源性为87.3％-98.7%,与A/swine/Guangxi/NS2783/2010(H3N2)株相近,且其与 JG04株的同源性为99.0%;NA基因也位于人源H3N2季节性流感分支,同源性为90.4%-98.3%,与A/swine/Hong Kong/2503/2011(H3N2)株关系较近,且其与JG04株的同源性为98.7%;其内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS皆位于pdm/09亚群上,各基因与 pdm/09亚群间的同源性在95.2%-99.6%之间,JG04株的HA基因位于人源H3N2季节性流感分支,同源性为87.3%-98.8%,;NA基因也位于人源 H3N2季节性流感分支,同源性为90.2%-98.0%,内部基因PB2、PB1、PA、NP和M皆位于pdm/09亚群上,各基因与pdm/09亚群间的同源性在96.1%-99.1%之间,NS基因则位于古典猪流感谱系,同源性在90.9%-95.0%之间;DX24与DX31毒株8个基因皆位于pdm/09亚群,各基因与 pdm/09亚群间的同源性在95.5%-99.2%之间,与芬兰地区2012-2013年间的pdm/09毒株关系最为密切;BB2株8个基因皆位于欧洲类禽H1N1SIV谱系,同源在87.1%-99.7%之间,各基因均与江苏地区的欧洲类禽H1N1SIV关系最为密切。
　　可知,NN01株和JG04株都具有类似于北美三源重配 SIV的TRIG(Triple reassortant internal gene,TRIG)盒的特点,NN01株为外部基因(HA和NA)来源于人源季节性流感,内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)来源于pdm/09毒株的三源重配H3N2亚型SIV;JG04株为外部基因(HA和NA)来源于人源季节性流感,内部基因中的PB2、PB1、PA、NP、M来源于 pdm/09毒株以及 NS基因来源于古典猪流感病毒的三源重配H3N2亚型SIV;DX24和DX31毒株全基因8个均来自人源pdm/09毒株;BB2是全基因8个片断均来源于欧洲类禽猪流感毒株的H1N1亚型SIV。
　　对5株SIV分离株各基因氨基酸序列关键位点进行分析后发现,5株毒株的PB2氨基酸序列的宿主相关保守位点中,第627aa均为E(Glu),说明这5株PB2基因均来源于禽,且JG04株其PB2基因为T588I,这一突变与增强毒力有关;另外,5株分离株皆含有截断的PB1-F2蛋白,其具体作用仍未清楚。5株病毒株其 HA蛋白受体结合位点均发生了 E190D和G225E/D(以H3为标准)的变异,表明都可以与SAα-2,6-Gal受体结合,其在HA裂解位点上都只存在1个R残基,属于低致病性毒株的HA氨基酸特征;结合5株病毒在NS1蛋白上92aa都为D,且都没有PDZ功能域的相关序列,推测5株病毒都是属于低致病性毒株。
　　NN01和JG03在NA基因氨基酸序列274aa上为H(以N2为标准),DX24、DX31和BB2这3株分离株在这一位点上为均为275H(N1为标准),均具有耐Oseltamivir的特性。而5株分离株在M2蛋白上均存在S31N的突变,说明均对金刚烷胺类药物具有耐药性。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 综 述

1.1 流感病毒病原学

第二章 实验方法

第一节 材料与方法

第三章 实验结果

3.1 分离株阳性鉴定

3.2 分离株基因组的扩增

3.3 分离株的克隆鉴定

3.4 H3N2和H1N1亚型猪流感病毒基因组的同源性分析

第四章 H3N2和H1N1亚型猪流感病毒的遗传进化分析

4.1 PB2基因分析

4.2 PB1基因分析

4.3 PA基因分析

4.4 HA基因分析

4.5 NA基因分析

4.6 NP基因分析

4.7 M基因分析

4.8 NS基因分析

4.9 基因溯源概括

第五章 讨论

5.1 H3N2亚型

5.2 H1N1亚型

5.3 全文讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录