猪星状病毒分离鉴定及其全基因组序列分析和衣壳蛋白原核表达

摘要

星状病毒(Astrovirus,AstV)是一类可感染人及其他多种动物的肠道疾病相关病原。目前该病毒已经从人、猪、牛、蝙蝠、犬、猫等31种哺乳类动物和鸡、火鸡、鸭和鸽子等6种禽类中检测出来,然而星状病毒感染与动物肠道疾病之间的关系并没有得到深入的了解。基因变异性已在许多种动物星状病毒中发现,但是由此产生的抗原性差异仅在人星状病毒中得到证实。此外,越来越多的研究证据表明星状病毒之间可以发生基因重组。由此可知,星状病毒的多宿主性、基因差异性及其重组现象和跨种间传播及适应新宿主的能力,使得星状病毒成为潜在的新兴人畜共患病原。本研究旨在探究猪星状病毒的分离培养特性和分析其遗传变异规律和衣壳蛋白的抗原特性,从而为进一步加深对猪星状病毒的了解而提供一定的理论支持和实践依据。
　　本研究采用 RT-PCR检测为猪星状病毒阳性的猪粪便上清进行病毒分离;在添加胰酶的条件下,分离得到1株能在PK-15细胞上稳定增殖20代同时产生明显细胞病变(CPE)的猪星状病毒(PAstV-GX1)毒株,病毒的TCID50为106.22/ml。然而在不添加胰酶条件下,病毒的致细胞病变能力显著降低。通过采用常规PCR,3′RACE及5′RACE等方法,基本获得分离毒株的全基因组序列,序列长6342bp,包括大部分 ORF1a,完整的ORF1b及ORF2,3′非编码区和poly(A)尾。全基因组核苷酸序列同源性分析表面,分离株 PAstV-GX1与目前唯一一株 MAstV3型星状病毒全序列(PAstV-Shanghai)的同源性最高(83.2％),而与其他基因型猪星状病毒的同源性不到50%。由全长衣壳蛋白基因ORF2构建的遗传进化分析表明,PAstV-GX1与PAstV-Shanghai及其他MAstV3型星状病毒处于同一分支,与加拿大分离株PAstV-12-3的亲缘性最近,且相比于其他猪星状病毒毒株,PAstV-GX1与经典型人星状病毒的亲缘性最近。此外,核苷酸序列分析发现,PAstV-GX1基因组存在星状病毒保守的3个特殊的核苷酸序列,即核糖体移位序列,亚基因组转录启动子序列及基因组3′端的茎环结构序列。
　　在由基因组推导的非结构蛋白和结构蛋白氨基酸序列分析发现,ORF1a的5′端存在5个跨膜螺旋结构;在nsp1a的aa50及aa500附近存在2个卷曲螺旋结构。衣壳蛋白序列分析发现,猪星状病毒 ORF2推导编码的氨基酸序列存在保守区和变异区,分别为aa1～aa419和aa420~aa750,并且衣壳蛋白的5′和3′端存在2个抗原指数较高的区域。本研究成功实现了PAstV-GX1衣壳蛋白基因 ORF2高度变异区的原核蛋白表达。通过Western-blot方法分析发现,本实验获得的重组蛋白具有良好的反应原性,为进一步的免疫原性的鉴定及血清学病原诊断试剂盒的开发提供了重要的基础。

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第一章 综 述

1.1 简介

1.2 AstV病原学特性

1.3 病毒培养特性

1.4 流行病学

1.4 临床症状及致病性

1.6 公共卫生意义

1.7 SMART 技术

1.8 本研究的目的与意义

第二章 猪星状病毒分离和鉴定

2.1 材料与试剂

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论与分析

第三章 猪星状病毒分离株PAstV-GX1全基因组序列扩增与分析

3.1 材料与试剂

3.2 主要仪器设备

3.3 主要培养基及缓冲液

3.4 方法与步骤

3.5 实验结果

3.6 序列分析

3.7 遗传进化分析

3.8 ORF2衣壳蛋白基因免疫原性预测

3.9 分析与讨论

第四章 PAstV-GX1衣壳蛋白原核表达及其反应原性分析

4.1材料与试剂

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 分析与讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录 PAstV-GX1 核苷酸序列

致谢