猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的优化与疫苗免疫试验研究

摘要

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种可引起受感染猪群水样腹泻、呕吐和脱水等症状的高度接触性急性肠道传染病病原。因该病分布广、发病急且各年龄段、各品种猪均可感染发病,特别是对新生仔猪造成高死亡率,给养猪业带来了重大的经济损失。本研究通过优化PEDV N蛋白抗体的ELISA的检测方法,对当前商品化的疫苗和自家苗的免疫效果进行评估,以期为猪场选出一种免疫效果较好的疫苗和免疫方式。
　　本研究将纯化的原核表达N蛋白作为抗原包被酶标板,通过优化反应条件,最终确定ELISA反应条件为:重组N蛋白做20倍稀释,包被条件为37℃2h;封闭条件为5％脱脂奶粉4℃封闭过夜;待检血清做40倍稀释,与重组蛋白反应条件为37℃1h;山羊抗猪IgG二抗做8000倍稀释,与待检血清反应条件为37℃1h,TMB底物显色条件为室温10min,最后于酶标仪上读取 OD450值,当 OD450值大于等于0.161时判定为阳性,小于0.161则判为阴性。
　　鉴于猪流行性腹泻病毒严重的危害性,且国内常用的疫苗免疫效果不一。本研究随机选取广西某国有规模化猪场30日龄仔猪40头,分为8组,每组5头,将3种市售疫苗、两种自场苗、一株自制细胞苗,按各自疫苗免疫程序分别免疫各组,并在免疫后28天进行攻毒实验。结果显示各组疫苗免疫效果普遍不理想,试验猪只抗体水平普遍不高。其中市售的二联灭活疫苗相比于其他疫苗具有较好的免疫保护效果,其次是自家苗的组合免疫方法也有较好的免疫效果。实验结果显示,多种免疫方法交叉重复使用(例如:口服+后海穴注射),能提供相对较好的免疫效果。
　　本研究利用自己研制的ELISA抗体检测试剂盒,进行猪只体内PEDV抗体水平消长规律研究,结果显示,免疫自家灭活苗的母猪能产生较高的抗体水平,母猪的整体抗体水平在产前7天时达到最高,之后有所下降。而仔猪的PEDV母源抗体水平在7日龄时最高,之后成下降趋势,21日龄时接近最低水平。对比母猪和仔猪抗体水平发现,无论母猪抗体水平高低,仔猪的抗体水平都很低,两者之间没有明显的线性关系。

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第一章 综述

1 研究背景

2 国内外研究现状

3本研究的目的及意义

第二章 PEDV血清抗体间接ELISA检测方法的优化

1 材料试剂与方法步骤

2 结果与分析

3 讨论

第三章 PEDV疫苗免疫效果评估试验

1 实验材料

2 技术路线

3 实验结果

4 分析与讨论

第四章 PEDV抗体消长监测试验

1 实验材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 全文总结

参考文献

附录：英文缩写对照表

致谢

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