ALV实时荧光定量PCR检测方法的建立及重组腺病毒介导的RNAi抑制ALV-J复制的研究

摘要

J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus，ALV-J)是一种最常见的外源性禽白血病病毒，自1999年我国首次从商品代肉鸡中分离得到之后，全国各地相继报道了ALV-J的感染。ALV的感染可能会造成鸡群生长迟缓、产蛋率和受精率等生产性能的降低、肿瘤发生，同时会造成感染鸡的免疫抑制，给我国养鸡行业造成了巨大的经济损失。然而目前还没有一种药物可以治疗或者控制AL，除了净化措施之外，也需要探索一种有效的抗病毒感染的方法。
　　根据GenBank上ALV各亚群的三个主要编码基因gag、 pol、env中的保守序列设计了5对特异性引物，分别用于检测蛋白酶PR、反转录酶RT、整合酶IN、表面蛋白基因gp85和穿膜蛋白基因gp37。通过RT-PCR技术扩增出5对引物的目的片段，回收PCR产物进行克隆测序，测序正确后的样品用于制备标准品质粒，10倍系列连续稀释后进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR，建立检测的标准曲线，同时绘制熔解曲线。结果显示，建立的5条标准曲线扩增效率为92.6％-100.5％，相应的相关系数均超过0.994。经过熔解曲线、特异性试验结果分析，设计的5对引物只能扩增出ALV病毒，特异性好;敏感性试验结果显示，可以检测得到一个数量级拷贝数的标准品质粒。说明建立的方法敏感性高，可以用于检测ALV-J病毒各基因mRNA转录水平的试验。
　　试验通过构建重组腺病毒介导的RNAi以研究其在DF-1细胞上抑制ALV-J毒株HG03病毒复制的能力，应用建立的Real-time PCR方法检测病毒PR、RT、IN、gp85和gp37基因的mRNA转录水平和囊膜蛋白gp85的表达水平，经内参GAPDH校正后计算出mRNA相对表达量，与对照组相比判断其RNAi的抑制效果。首先根据GenBank中HPRS103毒株(Z46390.1)以及本实验室所测J亚型毒株HG03 gp85基因保守区域为靶序列，遵循siRNA设计规则，以及载体pHBAd-U6-RFP的要求，设计了三对寡核苷酸siRNA1、siRNA2和siRNA3。为方便连接载体，序列加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。干扰序列连接腺病毒载体后，与骨架质粒在HEK293细胞中进行同源重组，获得的3个重组载体分别命名为pAd-gp85-shRNA1、pAd-gp85-shRNA2和pAd-gp85-shRNA3，空载体为pAd-N。经测序鉴定正确后，制备重组病毒种子液并测定其滴度，分别达到1.26×1010PFU/mL、1.58×1010PFU/mL和1.26×1010PFU/mL，空载体滴度为2.0×1010PFU/mL。
　　用构建好的重组腺病毒在DF-1细胞上进行RNAi效果的观察。首先测定重组腺病毒感染DF-1细胞的最佳感染复数(the multiplicity of infection，MOI)为500。其次，用500 MOI的重组腺病毒感染长成单层的DF-1细胞，8h后按1×103 TCID50的量接种HG03病毒，接种后48h分别用建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测HG03各基因的mRNA相对转录水平。结果显示构建的重组腺病毒载体对HG03各基因都有抑制效果，对gp85基因抑制率为51.6％-82.0％，其中以pAd-gp85-shRNA2的抑制率最高，达82.0％;对其它4个基因的mRNA相对表达量也有所下调，不同的基因下调的幅度不同。IFA检测的结果显示，干扰组的荧光强度明显弱于阳性对照组的，而空载体对照组与阳性对照组的荧光强度没有明显区别，结果与Real-time PCR检测的相符。
　　本研究成功构建了重组腺病毒介导的ALV-J HPRS103 gp85基因的RNAi载体，通过在DF-1细胞上进行的干扰试验结果证实，构建的重组腺病毒干扰载体可有效抑制ALV-J分离株HG03在DF-1细胞上的复制。

目录

声明

摘要

主要英文缩略表

第一章 前言

1．1 禽白血病病毒研究进展

1．1．1 禽白血病病毒的病毒结构特性

1．1．2 禽白血病的诊断技术

1．1．3 禽自血病的防控

1．2 RNAi的研究进展

1．2．1 RNAi的发现及发展

1．2．2 RNAi的作用机制

1．2．3 RNAi在抗病毒治疗中的应用

1．2．4 腺病毒载体研究进展

1．2．5 禽白血病病毒RNAi研究进展

1．2．6 RNAi技术的展望

1．3 本课题研究的目的和意义

第二章 ALV PR／RT／IN／gp85／gp37基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

2．1 试验材料

2．1．1 病毒和细胞

2．1．2 主要试剂

2．1．3 载体和感受态细胞

2．1．4 主要仪器设备

2．2 方法

2．2．1 引物设计与合成

2．2．2 病毒、细胞总RNA提取

2．2．3 反转录

2．2．4 PCR扩增ALV PR／RT／IN／gp85和gp37基因和内参GAPDH

2．2．5 荧光定量PCR标准品质粒的制备

2．2．6 Real-time PCR的建立

2．2．7 Real-time PCR的特异性试验

2．2．8 Real-time PCR的敏感性试验

2．2．9 Real-time PCR的重复性试验

2．3 结果

2．3．1 ALV PPURT／IN／gp85／gp37的PCR扩增结果

2．3．2 标准品质粒的鉴定结果

2．3．3 标准品质粒的Real-time PCR扩增及标准曲线的建立

2．3．4 Real-time PCR熔解曲线分析

2．3．5 Real-time PCR特异性试验结果

2．3．6 Real-time PCR敏感性试验结果

2．3．7 Real-time PCR重复性试验结果

2．4 小结与讨论

第三章 腺病毒载体介导的RNAi抑制ALV-J在DF-1细胞上复制情况调查

3．1 试验材料

3．1．1 腺病毒载体构建相关试剂

3．1．2 IFA相关试剂

3．1．3 主要仪器设备

3．2 方法

3．2．1 siRNA序列的设计

3．2．2 重组腺病毒载体的构建

3．2．3 重组腺病毒的包装、扩增和纯化

3．2．4 重组腺病毒感染DF-1细胞最佳MOI的测定

3．2．5 IFA对ALV-J病毒滴度(TCID50)的测定

3．2．6 Real-time PCR检测PR／RT／IN／gp85／gp37基因mRNA转录水平

3．2．7 IFA检测重组腺病毒RNA干扰HG03囊膜蛋白的表达水平

3．2．8 统计学分析

3．3 试验结果

3．3．1 腺病毒载体pHBAd-U6-RFP的酶切鉴定及测序验证

3．3．2 重组腺病毒的滴度鉴定

3．3．3 重组腺病毒感染DF-1细胞最佳MO1的测定

3．3．4 IFA对ALV-JHG03病毒滴度测定结果

3．3．5 Real—time PCR检测PR／RT／IN／gp85／gp37基因mRNA转录水平

3．3．6 IFA检测重组腺病毒干扰HG03的复制

3．4 小结与讨论

第四章 结论

参考文献

致谢

个人简历

攻读学位期间发表论文情况