铝毒胁迫下大豆内参基因的筛选及相关基因表达分析

摘要

大豆(Glycine max L.，soybean)是豆科植物，在人类的生产、生活中起着重要的作用。研究表明在广西地区影响作物高产的主要因素是酸性土壤，而铝毒是酸性土壤的主要作用因子。在对大豆中ALMT和MATE基因、谷胱丙肽代谢相关基因以及胼胝质代谢相关基因表达分析时需要用到内参基因作校准。而近几年的研究表明，没有任何一个内参基因在所有的实验条件下都稳定表达，因此在实验中需要对内参基因的稳定性进行验证。
　　本实验以巴西10号（简称BX10）和本地2号（简称BD2）大豆为材料，采用1/5 Hoagland水培法对大豆进行0 mmol/L（对照）、0.5 mmol/L AlCl3处理，取处理6h、2d和12d的大豆根尖做材料，筛选出铝毒胁迫下大豆22个内参基因(18s rRNA、ABC、ACLB-2、 Actin、 CRK、CYP、ELF1A、ELF1B、F-box、G6PDH、Letin、MTP、Pept_S16、Peptidase_S10、PP2A、RBO、SUBI-2、TIF、TUB、UBC2、UNK1、UNK2)中稳定表达的基因，用ΔCt值分析、GeNorm、NormFinder和BestKeeper这四种方法对内参基因进行分析，结果如下:
　　(1)用ΔCt值分析法分析内参基因的稳定性，在所有的样品中MTP基因稳定性最好，ABC基因是最不稳定的基因;(2)用GeNorm软件分析内参基因的结果为:在所有的样本里面最稳定的是Peptidase_S10和MTP，最不稳定的是UNK1，分别对基因在BX10和BD2品种表达进行分析，结果显示，在BX10里面最稳定的是Peptidase_S10和CYP基因，最不稳定的是UNK1，在BD2里面最稳定的是RBO和UBC2，最不稳定的基因是ABC;(3)用NormFinder软件分析的结果为:对整体样本进行分析时结果显示，UBC2基因在整体样本中表达最稳定;UNK1在整体样本中的表达是最不稳定的。对BX10的样本进行分析结果发现，MTP基因在BX10样本中的表达很稳定，UNK1基因BX10样本中的表达最不恒定;对BD2样本进行分析，结果显示ELF1A基因在BD2的样品中表达最稳定，Letin基因在BD2中是最不稳定的;(4) BestKeeper法分析结果为:在整体样本中最稳定的是Pept_S16稳定的，最不稳定的是ABC，在BX10里面最稳定的是TIF，最不稳定的是UNK1，在BD2样品里面最稳定的是F_box，最不稳定的是ABC。
　　选用MTP和UBC2这两个基因作为内参基因校准ALMT和MATE基因、谷胱丙肽代谢相关基因(hGSHS、hPCS、γ-ECS、GPX、 GR、GST)以及胼胝质代谢相关基因(CalS2、CalS3、CalS5、CalS7、CalS8、CalS9、CalS10、CalS11、CalS12、BG1、BG2)的表达，结果表明ALMT、GST、CalS7、CalS8等基因在铝毒胁迫下的表达与对照相比变化明显，说明这些基因参与了植物的耐铝机制。以不同的基因为内参时发现，同一个基因的在相同的样本中的表达结果存在着差异，因此在分析基因表达时使用多个内参基因会使结果更可靠。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 大豆及其在广西发展现状

1．2 铝的形态

1．3 铝的作用部位

1．4 铝毒伤害机理

1．5 植物抗铝毒机制

1．5．1 外部排斥机制

1．5．2 内部忍受机制

1．6 耐铝基因的研究进展

1．6．1 ALMT基因研究进展

1．6．2 MATE基因研究进展

1．7 植物谷胱甘肽代谢

1．8 胼胝质代谢相关酶基因

1．9 荧光定量PCR

1．10 内参基因

1．10．1 内参基因筛选的必要性

1．10．2 内参基因稳定性分析方法

1．11 实验的目的与意义

第二章 实验方法

2．1 技术路线

2．2 大豆的培养

2．3 RNA提取和保存

2．4 DNA的去除

2．5 RNA质量检测

2．6 cDNA的合成

2．7 内参基因引物设计和实时定量

2．7．1 内参基因引物设计

2．7．2 内参基因引物梯度PCR

2．7．3 引物的扩增效率和实时荧光定量

2．7．4 内参基因稳定性数据分析

2．8 目的基因实验和数据处理

2．8．1 目的基因引物设计

2．8．2 引物梯度PCR

2．8．3 目的基因克隆与转化

2．8．4 目的基因荧光定量PCR

2．8．5 数据处理和分析

第三章 结果与分析

3．1 大豆根尖总RNA的提取

3．2 内参基因结果

3．2．1 内参基因引物梯度PCR

3．2．2 引物的扩增效率

3．2．3 扩增曲线和熔解曲线

3．2．4 Ct值的可靠性分析

3．2．5 基因稳定性分析

3．3 目的基因

3．3．1 目的基因引物梯度PCR扩增

3．3．2 菌液PCR图

3．3．3 测序结果比对

3．3．4 目的基因熔解曲线

3．3．5 目的基因荧光定量结果分析

第四章 讨论

4．1 荧光定量PCR技术

4．2 评价内参稳定的方法

4．3 内参基因分析

4．4 目的基因荧光定量结果讨论

4．4．1 ALMT和MATE基因

4．4．2 谷胱丙肽代谢相关酶基因

4．4．3 胼胝质代谢相关基因

第五章 结论

第六章 创新点、展望

6．1 论文创新点

6．2 展望

致谢

参考文献

附录