嗜盐α-淀粉酶的鉴定及其与嗜盐相关的氨基酸残基研究

摘要

嗜盐α-淀粉酶具有独特的盐适应机制，使其在各种高盐等极端环境中，依然能够高效、稳定地行使其生物催化能力，在精密化工、水产、食品及其诊断试剂等众多行业中，都具有广阔的应用前景。目前，虽然嗜盐酶的相关研究已经成为一个热点，但是目前嗜盐酶的盐适应性机理还处于假说阶段，还不能完全解释嗜盐酶的嗜盐分子机理，因此继续嗜盐酶的相关研究，对探索其嗜盐的本质就显得尤为重要。
　　从非嗜盐的大肠杆菌JM109中克隆到一个嗜盐α-淀粉酶基因并重组表达。通过蛋白比对、同源建模，确定Na+结合位点上的氨基酸残基，并对相应位点进行定点突变，以此来初步探索嗜盐淀粉酶的嗜盐特性和机理。突变酶的酶学性质研究结果表明，相对于野生酶而言，突变酶K6-N204D和K6-P368G更加嗜盐，其最适NaCl浓度由野生酶的2 mol/L增加到3 mol/L，具有更好的嗜盐性，最适pH均为7.0，最适温度分别为55℃、50℃，比活力分别为18200 U/mg和4831U/mg。此外突变酶K6-N204D和K6-P368G在无NaCl情况下，也显示出了酶活，虽然其比活偏低仅为30 U/mg和130 U/mg，但是相对于野生酶K6而言，已是很大的改变。而K6-R208D-N209H-A211E三点连续突变后，其蛋白酶在有无NaCl情况下，均不显示出酶活。
　　与此同时，本文还从同样属于非嗜盐菌的根癌农杆菌EHA1252中获得一个嗜盐α-淀粉酶基因，经表达纯化，研究其相关的酶学性质，测定结果显示，其最适NaCl浓度达到近饱和的5.5 mol/L，而在无NaCl情况下，完全没有酶活，显示了更强的盐依赖性。将嗜盐α-淀粉酶与2％的可溶性淀粉反应后，经HPLC检测，其产物均为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的混合物。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 淀粉概述

1．2 淀粉酶简介

1．3 淀粉酶的来源

1．4 淀粉酶的分类

1．5 α-淀粉酶

1．5．1 α-淀粉酶的特点

1．5．2 α-淀粉酶的空间结构

1．5．3 α-淀粉酶的理化性质

1．5．4 α-淀粉酶的应用

1．6 嗜盐微生物

1．6．1 嗜盐微生物简介

1．6．2 嗜盐微生物的分类

1．6．3 嗜盐微生物的嗜盐机理

1．7 嗜盐酶

1．7．1 嗜盐酶概述

1．7．2 嗜盐酶应用

1．7．3 嗜盐酶盐适应性的机理研究

1．8 蛋白质分子改造

1．8．1 易错PCR

1．8．2 定点突变

1．9 课题研究依据及意义

1．10 有关技术路线

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种和质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要酶制剂

2．1．4 各种常用培养基及其溶液的配置

2．1．5 主要的仪器设备

2．2 实验的具体方法和步骤

2．2．1 细菌总DNA的提取

2．2．2 质粒提取方法

2．2．3 感受态细胞的制备

2．2．4 重组质粒的连接构建

2．2．5 重组质粒的转化

2．2．6 信号肽预测

2．2．7 引物的设计

2．2．8 PCR扩增

2．2．9 重组质粒的验证

2．2．10 重组淀粉酶基因的诱导表达

2．2．11 重组淀粉酶目的蛋白的纯化

2．2．12 镍柱亲和层析纯化目的蛋白具体操作步骤如下

2．2．13 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

2．2．14 标准曲线的测定

2．2．1 5 DNS法测定产还原糖淀粉酶酶活原理

2．2．16 淀粉酶酶活测定

2．2．17 酶学特性研究

2．2．18 HPLC对淀粉酶水解产物的分析条件

2．2．19 同源建模及其定点突变位点的选择

第三章 结果与分析

3．1 根癌农杆菌EHA1252基因序列分析

3．1．1 信号肽的预测

3．2 根癌农杆菌EHA1252总DNA的提取

3．3 根癌农杆菌EHA1252基因的克隆

3．4 根癌农杆菌EHA1252重组质粒验证

3．4．1 重组质粒双酶切验证

3．4．2 重组质粒测序验证

3．5 根癌农杆菌EHA1252重组酶嗜盐性质的鉴定

3．6 重组酶pSE380-EHA1252蛋白表达及其纯化

3．7 根癌农杆菌EHA1252相关嗜盐性质的研究

3．7．1 重组酶在不同盐溶液条件下的酶活

3．7．2 重组酶在不同缓冲液环境下的酶活

3．7．3 在有NaCl存在时的最适pH

3．7．4 重组酶的最适温度

3．7．5 重组酶的最适NaCl浓度

3．7．6 重组酶的pH稳定性

3．7．7 重组酶的热稳定性

3．7．8 Ca2+对重组酶活影响

3．7．9 EDTA对重组酶活性的影响

3．7．10 不同金属离子对重组酶活性的影响

3．7．11 不同有机溶剂对重组酶活性的影响

3．7．12 HPLC对重组酶EHA1252水解产物的检测分析

3．7．13 重组酶EHA1252的比活力测定

3．7．14 重组酶EHA1252的Km、Vmax值的测定

3．8 不同来源嗜盐α-淀粉酶比对分析

3．8．1 DNA和氨基酸的比对分析

3．9 对本文所研究的嗜盐酶基因进行进化树的分析

3．10 不同来源的嗜盐α-淀粉酶酶学性质的比对

3．11 嗜盐α-淀粉酶嗜盐相关的氨基酸残基研究

3．11．1 研究材料的选择

3．11．2 K6定点突变位点的选择

3．12 嗜盐淀粉酶点突变基因K6-N204D-K6-P368G的克隆

3．13 K6点突变重组质粒验证

3．13．1 重组质粒双酶切验证

3．13．2 重组质粒测序验证

3．14 嗜盐淀粉酶K6点突变蛋白表达及其纯化

3．15 突变酶K6-N204D、K6-P368G的酶学性质研究

3．15．1 嗜盐淀粉酶在不同盐溶液条件下的酶活

3．15．2 嗜盐淀粉酶在不同缓冲液环境下的酶活

3．15．3 突变型嗜盐淀粉酶K6的最适pH

3．15．4 突变型嗜盐淀粉酶K6的最适温度

3．15．5 突变型嗜盐淀粉酶K6的最适NaCl浓度

3．15．6 突变型嗜盐淀粉酶K6的pH稳定性

3．15．7 突变型嗜盐淀粉酶K6的热稳定性

3．15．8 Ca2+对突变型嗜盐淀粉酶k6的酶活影响

3．15．9 EDTA对突变型嗜盐淀粉酶K6的酶活影响

3．15．10 不同金属离子对突变型嗜盐淀粉酶K6的酶活影响

3．15．11 有机溶剂对突变型嗜盐淀粉酶k6的酶活影响

3．15．12 NaCl对非嗜盐α-淀粉酶活力的影响

3．15．13 HPLC对突变型嗜盐淀粉酶K6-N204D、K6-P368G水解产物的检测分析

3．15．14 突变酶K6-N204D、K6-P368G比活力测定

3．15．15 突变酶K6-N204D、K6-P368G的Km、Vmax测定

第四章 讨论

4．1 嗜盐淀粉酶

4．2 嗜盐酶盐适应性机理

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

致谢

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