体外囊胚培养风险及穿心莲内酯对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

摘要

随着社会发展，多种因素导致人类生育能力下降，辅助生殖技术得以广泛开展;而与此同时，人们对生殖风险也越发关注，尤其是卵子成熟与胚胎发育会涉及后代健康，对其相关风险则更加关切。本研究将通过辅助生殖的体外培养技术，围绕女性生殖的风险，研究一种妊娠风险的胚胎发育因素和一种不育风险的卵子成熟药物影响。
　　研究一:同卵双生(MZT)妊娠具有胎儿发育异常高风险。研究发现，MZT风险的增加与辅助生殖技术有一定的相关性，尤其是胚胎体外延长培养，即体外囊胚培养。然而，引起同卵双生的原因迄今并不清楚。本试验主要研究了小鼠体外囊胚培养在孵化过程中的表现，观测透明带开口的大小（小开口引起“8”型孵化，大开口引起“U”型孵化）与内细胞团分裂之间的关系。小鼠囊胚孵化观察了三组(1)体内发育来源的囊胚;(2)体内受精体外培养发育来源的囊胚;(3)体外受精来源的囊胚。体外培养的(2)(3)两组囊胚“8”型孵化率显著高于体内组(1)组(0.8％，21.9％，20.4％，n=841，P＜0.01)。用Oct-4免疫荧光染色来鉴定孵化囊胚和完全孵出囊胚的内细胞团，发现一个囊胚存在两个阳性的内细胞团，则是内细胞团分裂。实验发现，经过“8”型孵化的囊胚，其内细胞团分裂率比经“U”型孵化的囊胚内细胞分裂率要显著增加(12.5％vs1.9％，n=841，P＜0.01)。
　　因此，研究结果证实体外囊胚培养能引起高频率囊胚“8”型孵化，而“8”型异常孵化易导致内细胞团分裂风险的增加。该试验结果为阐明体外受精和囊胚移植后人类MZT风险的增加提供了重要依据和线索。
　　研究二:穿心莲作为常用抗感染药物对女性生殖健康是否安全还不清楚。穿心莲内酯是中草药穿心莲的主要有效成分之一，它是从天然植物穿心莲中提取得到的二萜内酯类化合物，通常用于治疗上呼吸道感染以及痢疾等疾病。前期研究表明穿心莲内酯对雄性大鼠有一定的生殖毒性，然而，穿心莲内酯对生发泡期卵母细胞体外成熟的影响尚未见相关报道。本项研究主要评估了穿心莲内酯对小鼠生发泡期卵母细胞体外成熟的影响。从3～4周龄的昆明雌性小鼠卵巢中获得生发泡期的卵母细胞，将获得的未成熟卵子分别在含有0、5、10、20μM穿心莲内酯的KSOM培养基中孵育0、6、12、24h。处理后在不同时间点观察生发泡破裂以及第一极体排出情况。然后通过激光共聚焦显微镜观察纺锤体的形态、微丝蛋白的表达、分布以及用TUNEL和JC-1检测卵母细胞的凋亡和线粒体分布等情况。
　　研究结果表明，穿心莲内酯处理小鼠卵母细胞后其成熟率显著下降，可能因细胞骨架遭破坏所致:(1)穿心莲内酯处理过后，卵母细胞形态以及纺锤体形态明显异常;(2)微丝蛋白的表达以及分布也遭到破坏;(3)染色体的组装明显受到干扰。结果还表明，卵母细胞的凋亡率明显增加，受精率显著降低。
　　总之，研究结果表明，穿心莲内酯影响了体外卵母细胞减数分裂成熟和凋亡，暴露于穿心莲内酯的卵母细胞大部分的染色体异常组装，纺锤体正常形态被破坏，呈现多极、单极等现象，随之染色体迁移也被抑制，具有时间和剂量依赖性。
　　试验进一步探讨了体内注射穿心莲内酯对小鼠卵母细胞成熟的影响并从纺锤体分布的角度分析其影响卵母细胞受精的机制。结果显示:小鼠腹腔连续注射穿心莲内酯8d(剂量100mg/Kg)，体外成熟24h后对照组与处理组成熟率不存在显著差异(74.44％vs71.79％，P＞0.05)。小鼠腹腔连续注射穿心莲内酯16d(剂量100mg/Kg)，体内卵母细胞成熟率不存在显著差异(96.30％vs89.74％，P＞0.05)，但处理组卵母细胞的卵胞质碎片数量显著增加（3.70％vs10.26％，P＜0.05），小鼠卵母细胞行单精子注射，处理组受精率显著降低（89.47％vs24.51％，P＜0.05）。免疫荧光结果显示，穿心莲内酯处理后纺锤体形态与对照组不存在显著差异(P＞0.05)，减数分裂中期的纺锤体呈两端逐渐变细的“纺锤状”，且靠近卵膜位置。根据研究结果表明，小鼠腹腔连续注射穿心莲内酯8d(剂量100mg/Kg)，对体外成熟的卵母细胞成熟率没有显著影响，小鼠腹腔连续注射穿心莲内酯16d（剂量100mg/Kg），对体内成熟的卵母细胞成熟率没有显著影响，但影响卵母细胞胞质的成熟质量，且降低了卵母细胞的受精能力。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的研究进展

1．1 卵母细胞体外成熟培养技术研究简史

1．2 卵母细胞体外成熟

1．3 卵母细胞体外成熟的评判标准

1．4 影响卵母细胞体外成熟的主要因素

1．5 目前卵母细胞体外成熟培养所存在的问题

1．6 卵母细胞体外成熟的意义

1．7 卵母细胞体外成熟研究展望

2．胚胎体外操作培养与同卵双生相关性的研究进展

2．1 同卵双生的概念及其相关风险

2．2 辅助生殖技术治疗中影响同卵双生发生的相关因素

2．3 MZT发生机制的相关假说

2．4 存在的问题及展望

第二章 在体外培养小鼠囊胚孵化过程中透明带上开口大小与内细胞团分裂的关系

前言

1 试验材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 数据分析

1．4 试验设计

2 试验结果

2．1 人类囊胚行透明带小开口切割与“8”字样孵化及双内细胞团的关系

2．2 小鼠囊胚透明带小开口自然孵化与囊胚“8”字样孵化率的关系

2．3 “8”字样孵化囊胚对内细胞团的影响

2．4 “8”字样孵化囊胚的移植结局

3 分析与讨论

4 结论

第三章 穿心莲内酯对小鼠GV期卵母细胞体外成熟的影响及其相关的机制研究

前言

1．试验材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 试验设计

1．4 数据分析

2．试验结果

2．1 不同剂量穿心莲内酯对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

2．2 不同剂量穿心莲内酯对含有和不含颗粒细胞fltJd'鼠卵母细胞体外成熟的影响

2．3 卵母细胞在20μM穿心莲内酯中暴露不同时间对其体外成熟的影响

2．4 卵母细胞经20μM穿心莲内酯处理14小时后对纺锤体和微丝的影响

2．5 体外成熟过程中穿心莲内酯对小鼠卵母细胞凋亡的影响

2．6 体外成熟过程中穿心莲内酯对小鼠卵母细胞线粒体分布的影响

2．7 穿心莲内酯对体外成熟卵母细胞受精潜能的影响

2．8 穿心莲内酯对体内成熟卵母细胞受精潜能的影响

3 分析与讨论

4 结论

第四章 体内注射穿心莲内酯对小鼠卵母成熟的影响及其相关的机制研究

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 试验设计

1．4 数据统计与分析

2 试验结果

2．1 腹腔注射穿心莲内酯对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

2．2 腹腔注射穿心莲内酯对小鼠卵母细胞体内成熟的影响

2．3 穿心莲内酯影响卵母细胞受精率的机制研究

3 分析与讨论

4 结论

总结

参考文献

英文缩写-中文对照表

致谢

攻读博士期间发表文章