3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯抑制番茄青枯病菌的机制及防病作用研究

摘要

番茄青枯病是由茄青枯拉尔氏菌（Ralstonia salanocearum）引起的一种毁灭性土传病害。目前对该病害的防治仍以使用化学药剂为主，由于防治该病害的药剂种类少，且长期使用后病原菌对目前使用的药剂已产生不同程度的抗性，导致防效降低。因此，农业生产迫切需要开发防治植物青枯病的高效、低毒、低残留的新型药剂。
　　前期的研究表明，从木蜡树叶片提取物中分离得的3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯(Methyl Gallate，MG)对茄青枯拉尔氏菌有较强抑制作用。但MG对茄青枯拉尔氏菌抑制机制和对茄青枯病的防治作用研究不够深入。因此，本文测定MG对茄青枯拉尔氏菌生理生化的影响，分析茄青枯拉尔氏菌菌体的蛋白质组在MG的抑制作用下发生的变化情况，测定MG对番茄青枯病的防治作用和在番茄植株的传导特性，取得的主要结果如下:
　　1.MG能够破坏茄青枯拉尔氏菌菌体细胞壁的完整性、抑制纤维素酶和果胶酶的产生、降低病菌的过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性，可通过促使NADH/NAD+比值的升高，抑制病菌的糖酵解-三羧酸循环。
　　2.在20μg/mLMG作用下，R.solanacearum菌体蛋白质表达差异明显的蛋白质有29个，采用质谱技术鉴定出22种差异蛋白质，其中新增蛋白11种、缺失蛋白5种、表达上调蛋白1种和表达下降蛋白5种。这些蛋白包括参与能量代谢、信号转导、物质运输和转录修复相关的蛋白。初步推测MG对茄青枯拉尔氏菌应有多个作用靶标，其中抑制菌体的能量代谢可能是MG对茄青枯拉尔氏菌的抑制作用的机制之一。
　　3.将MG作用后茄青枯拉尔氏菌新增蛋白F0F1ATP合酶ε亚基的基因RSc3316进行敲除，获得了缺失突变体ΔDM3316以及该突变体的互补菌株ΔCM3316，为研究MG作用茄青枯拉尔氏菌后的新增蛋白F0F1ATP合酶ε亚基的基因功能打下基础。
　　4.MG对番茄青枯病的保护作用有较长的持效期，施药15d后接种青枯病菌，防效仍达52.15％，接种病原菌5d后施用MG的植株，防治效果仅为13.03％，说明该药剂对番茄青枯病的治疗作用较弱。MG可被番茄植株根系快速吸收，番茄根部浸泡MG再接种病原的防效达96.67％。MG在番茄植株内的向顶和向基的传导性则很差，根部浸MG后叶部接种和叶片施MG后根部接种的防效分别为14.44％和9.44％。
　　5.MG处理后番茄根系与生根和抗病相关的酶活性以及次生代谢物质发生变化。与用0.1％甲醇溶剂处理的植株比较，用MG处理后的番茄植株，IAAO活性下降，POD活性没有明显变化，但PPO活性上升。用MG处理并接种病原菌的植株，PAL活性持续增加。苗期和大田期施用MG处理的番茄根系，与抗病相关的香叶醇、豆甾醇、β-谷甾醇和木栓醇等的含量均高于用0.1％甲醇溶剂处理的番茄植株。
　　6.MG对番茄种子的萌发有一定的促进作用。20μg/mL和50μg/mL的MG、清水和0.1％甲醇溶剂处理在第4d的萌发率分别为73.38％、66.69％、53.33％、48.89％，20μg/mL和50μg/mL的MG处理的种子萌发率均显著高于清水和0.1％甲醇溶剂处理。
　　7.MG对番茄青枯病有较好的防治作用。0.5 g/L的MG和20％噻森铜悬浮剂对番茄青枯病的防效分别为60.22％和48.86％。MG处理的亩产量为2982.4 kg，与清水CK处理比较，增产率达153.99％，且对土壤中的细菌种类和数量没有造成影响。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 番茄青枯病的病原及其防治状况

1．1．1 番茄青枯病的病原

1．1．2 番茄青枯病的防治方法

1．2 植物源杀菌剂的研究现状

1．2．1 抑菌植物种类

1．2．2 抑菌物质的抑菌机制

1．2．3 目前己投入市场植物源农药的种类

1．3 3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯研究现状

1．4 本研究的目的意义

2 3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯(MG)对茄青枯拉尔氏菌的细胞壁和生理生化的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 MG对茄青枯拉尔氏菌生长曲线的影响

2．1．3 菌液上清中的碱性磷酸酶(AKP)含量测定

2．1．4 MG对病菌胞外酶活性的影响

2．1．5 MG对茄青枯拉尔氏菌过氧化物酶(PoD)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响

2．1．6 MG对茄青枯拉尔氏菌的NADH和NAD+含量的影响

2．1．7 数据统计分析

2．2 结果与分析

2．2．1 MG对茄青枯拉尔氏菌生长曲线的影响

2．2．2 MG对茄青枯拉尔氏菌细胞壁完整性的影响

2．2．3 MG对病菌胞外酶活性的影响

2．2．4 MG对茄青枯拉尔氏菌POD和CAT活性的影响

2．2．5 MG对茄青枯拉尔氏菌的NADH和NAD+的影响

2．3 结论与讨论

3 茄青枯拉尔氏菌Rs-T02在3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯作用下的差异蛋白分析

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 茄青枯拉尔氏菌Rs-T02在3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯作用下差异蛋白的确定

3．1．3 质谱鉴定及生物学信息分析

3．1．4 二维电泳准确性的验证

3．2 结果与分析

3．2．1 3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯与茄青枯拉尔氏菌Rs-T02相互作用的差异蛋白质

3．2．2 差异蛋白的质谱鉴定

3．2．3 总RNA的提取

3．2．4 二维电泳的准确性

3．3 结论与讨论

4 FOF1 ATP合酶ε亚基基因(RScaS3316)缺失突变体及其互补菌株的构建

4．1 材料与方法

4．1．1 供试材料

4．1．2 缺失突变体的构建

4．1．3 三亲本接合

4．1．4 △DM3316互补菌株的构建

4．1．5 生长曲线测定

4．2 结果与分析

4．2．1 左右臂片段的PCR扩增

4．2．2 pK 18sacB重组质粒的构建

4．2．3 Rsc3316基因缺失突变体的构建

4．2．4 △DM3316突变体互补菌株的构建

4．2．5 缺失突变体及其互补菌株的生长曲线

4．3 结论与讨论

5 MG在番茄植株中的传导特性及对植株的生理生化影响

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 水培营养液成分及用量

5．1．3 MG的在番茄植株中的吸收传导特性

5．1．4 MG在番茄植株中的持效期及治疗作用测定

5．1．5 番茄根系次生代谢物质的GC-MS分析

5．1．6 番茄生根关联酶以及诱导抗性相关酶活性的测定

5．1．7 数据处理

5．2 结果与分析

5．2．1 MG在番茄植株中的吸收传导情况

5．2．2 MG对番茄青枯病的持效期

5．2．3 MG对番茄根系次生代谢的影响

5．2．4 MG对番茄植株根部相关酶活性的影响

5．3 结论与讨论

6 MG对番茄青枯病的防治作用及对番茄种子的萌发和土壤细菌数量的影响

6．1 材料与方法

6．1．1 材料

6．1．2 MG对番茄种子萌发的影响

6．1．3 MG对番茄青枯病的田间防效

6．1．4 MG对番茄根际土壤细菌数量的影响

6．2 结果与分析

6．2．1 MG对番茄种子萌发的影响

6．2．2 MG对番茄青枯病的防治作用

6．2．3 MG对番茄根际土壤细菌数量的影响

6．3 结论与讨论

7 结论

7．1 全文总结

7．2 创新点

7．3 后续研究设想

参考文献

致谢

在读期间发表的论文