吉富罗非鱼肝脏FAS、CAT基因的克隆及脂肪和胆碱、投饲率和投饲水平对其表达的影响

摘要

脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)是脂肪合成的关键酶，它催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸，而后与甘油合成脂肪，对动物脂肪的沉积起重要作用。过氧化氢酶(catalase，CAT)是一种广泛存在于动植物体内的氧化酶类，它主要用于分解体内的H2O2，防止机体及生物大分子的氧化损伤。本研究以吉富罗非鱼为研究对象，利用RT-PCR的方法克隆了肝脏FAS和CAT基因的cDNA全长，通过qRT-PCR方法分析了不同饲料脂肪水平和胆碱水平、不同投饲频率和投饲水平下，肝脏FAS和CAT基因的相对表达水平，主要研究结果如下:
　　1.本实验克隆得到了FAS、CAT基因cDNA全长，片段大小分别为8779bp和3063 bp，分别编码2511和527个氨基酸残基。序列比较结果显示，吉富罗非鱼与其他已知物种FAS、CAT基因氨基酸的相似性都比较高，分别为61％～78％和67％～92％;此外吉富罗非鱼推测氨基酸序列中存在与其他物种高度保守的特征序列，FAS包含酮脂酰合酶的活性位点C161、软脂酸硫解酶活性肽段“-SFGACVAF-”和烯酰还原酶的活性区域“-VFTTVGSMEKR-”，CAT包含血红素结合位点“-RLFSYPDTH-”和酶活性位点序列“-FDRERIPERVVHAKGAG-”，三个参与催化的氨基酸残基(His75、Asn148、Tyr358)，还有12个NADPH结合位点和C-末端的过氧化物酶体定位信号“SKM”。系统发育树构建结果表明分子生物学分类与传统分类结果相一致。生物信息分析显示，FAS、CAT蛋白均不含信号肽和跨膜结构域，亚细胞定位于细胞质中，推测它们为非分泌型蛋白。结构域预测显示，FAS推测蛋白含有β-酮脂酰合成酶的N端、C端结构域(ketoacyl-synt)和(Ketoacyl-synt_C)、酰基转移酶结构域(Acyl_transf_1)、脱水酶结构域(PS-DH)、烯基还原酶结构域(PKS_ER)，还含有酮基还原酶结构域(PKS_KR)、磷酸泛酰巯基乙胺附着位点(PP-binding)和硫酯酶结构域(Thioesterase)。CAT推测蛋白含有血红素-过氧化氢酶核心结构域(Catalase domain)和过氧化氢酶相关的免疫应答序列(Catalase-rel)。通过蛋白二级结构分析显示FAS、CAT二级结构都由α螺旋(Alpha helix)、延伸带（Extended strand）、无规则卷曲(Random coil)组成，两个蛋白三者的比例分别为35.84％、18.36％、45.80％和29.41％、19.17％、51.42％。结论:克隆得到了吉富罗非鱼FAS、CAT基因全长编码片段，生物信息分析显示FAS和CAT基因在不同物种中氨基酸序列和结构域都具有较高保守性，所编码蛋白都为细胞质蛋白。
　　2.为深入研究不同饲料脂肪和胆碱水平对吉富罗非鱼幼鱼肝脏FAS、CAT表达的影响，本试验采用qRT-PCR技术分别检测九组投喂不同脂肪水平和胆碱水平吉富罗非鱼肝脏中FAS、CAT基因mRNA的相对表达量，实验分组中饲料脂肪和胆碱水平分别为组1:4％和500 mg· Kg-1、组2:4％和750 mg·Kg-1、组3:4％和1000 mg· Kg-1、组4:8％和500 mg·Kg-1、组5:8％和750 mg· Kg-1、组6:8％和1000 mg· Kg-1、组7:12％和500 mg· Kg-1、组8:12％和750 mg· Kg-1、组9:12％和1000 mg· Kg-1;每组3重复，每重复50尾，养殖63天。结果显示:胆碱水平为500 mg· Kg-1时，肝脏FAS的相对表达量随脂肪水平的升高而逐渐降低，胆碱水平为750 mg·Kg-1时，随着脂肪水平的升高，FAS的表达量显著升高(P＜0.05)，当胆碱为较高水平(1000 mg·Kg-1)时，FAS表达量在脂肪水平为8％时达到峰值;当胆碱水平为750 mg·Kg和1000 mg· Kg-1时，肝脏CAT的相对表达量都随脂肪的增加而先升高后降低，脂肪为8％组显著高于4％组和12％组(P＜0.05)，而在胆碱水平较低(500 mg·Kg-1)时，CAT的表达量则随脂肪含量的升高而显著上升(P＜0.05)。结果说明，胆碱较低时饲料脂肪水平的增加会抑制FAS的表达，适量的胆碱添加可以消除这种抑制，然而过量的胆碱同样也会在高脂肪组对FAS的表达出现抑制作用;适当提高饲料脂肪水平会提高吉富罗非鱼的抗氧化能力，而过量的脂肪反而会抑制其抗氧化能力，但胆碱水平较低时（500 mg· kg-1）高脂肪组会激活CAT的大量表达。
　　3.为深入研究投喂频率和投喂水平对吉富罗非鱼肝脏FAS、CAT基因表达的影响，本试验采用qRT-PCR技术分别检测不同投喂频率和不同投喂水平的吉富罗非鱼肝脏中FAS、CAT基因mRNA的相对表达量，实验组投喂次数和水平分别为:2次·d-1和2％、2次·d-1和4％、2次·d-1和6％、2次·d-1和8％、2次·d-1和10％、3次·d-1和2％、3次·d-1和4％、3次·d-1和6％、3次·d-1和8％、3次·d-1和10％，每个组合设3个重复，每重复60尾，养殖70天。结果显示:投饲频率为每日2次时，随着投喂水平的升高，吉富罗非鱼肝脏中FAS基因的相对表达量先升后降，在投喂水平为10％时又再升高，其中4％、6％、8％组间差异不显著(P＞0.05)，但6％组显著高于2％组(P＜0.05)，且显著低于10％组(P＜0.05);每日投喂3次时，除2％组，其他各组FAS表达量随投喂水平的升高而先升后降再升高的趋势更明显，其中6％组显著高于4％、8％组(P＜0.05)，显著低于10％组(P＜0.05);当每日投喂2次时，肝脏CAT基因的表达量随投喂水平的提高，先下降，在8％组达到最低后，又上升;每日3次时，除2％组，其他组的这种先降后升的变化趋势有所提前，在6％组达到峰值。分析结果得知:吉富罗非鱼肝脏中FAS的表达量随投喂水平的增加而呈波浪式升高，投喂频率的增加增强了这种变化趋势;肝脏CAT的表达量随投喂水平的升高而先降再升，投喂频率的增加提前了这种变化趋势，同时抑制了低投喂水平时的表达量。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1 罗非鱼简介

2 FAS、CAT基因的研究进展

2．1 FAS的研究进展

2．2 CAT的研究进展

3 各因素对脂肪代谢及抗氧化的影响

3．1 饲料脂肪水平对脂肪代谢及抗氧化影响的相关研究

3．2 饲料胆碱水平对脂肪代谢及抗氧化影响的相关研究

3．3 投饲频率、投饲水平对脂肪代谢及抗氧化影响的相关研究

4 本研究的目的及意义

第二章 吉富罗非鱼FAS、CAT基因cDNA全长的克隆与分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 总RNA的提取

2．2 吉富罗非鱼FAS、CAT基因cDNA全长的扩增

2．3 吉富罗非鱼FAS、CAT基因的序列分析

3 讨论

3．1 吉富罗非鱼Total RNA的提取

3．2 PCR引物的设计及扩增条件的优化

3．3 吉富罗非鱼FAS、CAT基因及推导蛋白的分析

3．4 系统进化分析

第三章 饲料脂肪和胆碱水平对吉富罗非鱼肝脏FAS基因、CAT基因表达量的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果

2．1 饲料脂肪和胆碱水平对吉富罗非鱼FAS基因表达量的影响

2．2 饲料脂肪和胆碱水平对吉富罗非鱼CAT基因表达量的影响

3 讨论

第四章 投喂频率和投喂水平对吉富罗非鱼肝脏FAS基因、CAT基因表达量的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 投喂频率和投喂水平对吉富罗非鱼FAS基因表达量的影响

2．2 投喂频率和投喂水平对吉富罗非鱼CAT基因表达量的影响

3 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表论文情况