猪ANK1基因启动子活性与转录调控及多态性分析

摘要

我国是世界第一大猪肉生产和消费国。随着中国经济的快速发展，人们对猪肉的肉质要求越来越高。改良猪肉肉质性状将是育种工作的一个重点。ANK1（Ankyrin1）属于锚蛋白家族（Ankyrins）中的一员，其编码的蛋白AnkR(Ankyrin-R)由膜结合域(membrane-binding domain)和血影蛋白结合域（spectrin-binding domain）及调控域（regulatory domain）三部分构成。该基因不但与猪和牛的部分肉质性状有一定的相关，而且也与2型糖尿病的易感性、遗传性球形红细胞增多症、冠心病和阿尔茨海默症等有关。
　　在基因的表达调控过程中，基因的转录调控是一个非常重要的过程。基因的转录过程受到关键元件启动子的调控，启动子是一段能与RNA聚合酶和转录结合因子结合的DNA序列，它与相应转录因子相互作用来调控基因的表达。为了解猪ANK1基因的转录调控机制，本课题以广西巴马小型猪和长白猪作为研究对象，克隆了ANK1基因的启动子区域，对其核心区域进行研究。同时检测了广西巴马小型猪、德宝猪、陆川猪和长白猪ANK1基因启动子区域的SNP,研究结果如下:
　　1.成功克隆了广西巴马小型猪、长白猪ANK1基因启动子区约2074bp序列。从Ensembl截取猪ANK1基因5'端上游调控序列，利用在线软件PromoterScan、NNPP、Promoter2.0、Gene-regulation、MethPrimer等进行分析，发现克隆的2074bp片段存在很多的调控元件，例如TATAbox、GATA-1、SP1、myogenin、AP-2alpha、CEP-bind等，同时预测表明该区域存在两个CpG岛和两个核心启动子区域。
　　2.分别构建了长白猪和广西巴马小型猪ANK1启动子缺失片段双荧光素酶报告基因载体各8个，并转染C2C12细胞，检测各载体的荧光素酶活性。发现长白猪ANK1启动子活性最高的片段为PGL3-P3，巴马小型猪活性最高片段为PGL3-P2，推测ANK1基因启动子核心区域定位为-1080～-1991bp范围内。
　　3.检测发现广西巴马小型猪、长白猪ANK1基因启动子核心区域存在16个单核苷酸多态性位点，分别是-19、-133、-147、-187、-228、-246、-322、-360、-369、-468、-549、-550、-615、-696、-725、-798。其中-798、-468、-369位点SNP在广西巴马小型猪分别为C、C和G，在长白猪中分别为T、G和A。检测德保猪和陆川猪这三个特异性位点时发现，-468位点在广西巴马小型猪、陆川猪、德保猪中均为C，长白猪均为G。
　　4.ANK1基因核心启动子分析预测发现-468位点存在SP1、GCN4、C/EBP alph转录因子结合位点。通过点突变实验构建野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体，检测发现突变型和野生型双荧光素酶报告基因载体的荧光素酶活性具有极显著差异(P＞0.01);构建了SP1的真核表达载体，与野生型和突变型ANK1双荧光素酶报告基因载体进行共转时，发现荧光素酶活性显著降低(P＜0.05)。
　　5.利用荧光定量PCR技术检测了巴马小型猪的ANK1基因在猪11个组织中的表达情况，结果揭示这11个组织中ANK1基因均有差异性表达，其中在胰腺中表达量最高，脂肪中表达量最低。成功构建了ANK1基因CDS区真核表达载体，转染细胞并于转染后48h观察到细胞发出绿色荧光。

目录

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论文说明

摘要

缩略词中英文对照表

第一章 文献综述

1．1 前言

1．2 启动子研究概述

1．2．1 启动子结构

1．2．2 转录因子与启动子

1．3 单核苷酸多态性

1．4 组织表达谱

1．5 影响猪肉品质相关基因的研究

1．5．1 猪肉品质的研究

1．5．2 锚蛋白(ANK)的研究

1．5．3 ANK1与肉质的研究

1．6 研究目的和意义

第二章 猪ANK1基因启动子生物信息学分析与启动子活性验证

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 猪ANK1基因启动子生物信息学分析

2．2．2 猪ANK1基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建

2．2．3 猪ANK1基因启动子活性分析

2．3 讨论与小结

2．3．2 小结

第三章 猪ANK1基因核心启动子区定位及SNP分析

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 猪ANK1基因启动子核心启动子区的定位

3．2．2 猪ANK1核心启动子区SNP分析

3．2．3 陆川猪与德保猪部分SNP验证

3．3 讨论与小结

3．3．1 猪ANK1基因启动子核心区域

3．3．2 小结

第四章 猪ANK1基因核心启动子点突变与转录因子超表达

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 猪ANK1基因核心启动子区点突变与活性

4．2．2 构建转录因子SP1的过表达载体

4．2．3 猪ANK1基因启动子转录因子过表达与活性

4．3 讨论与小结

4．3．1 点突变对ANK1基因启动子活性的影响

4．3．2 小结

第五章 ANK1基因组织表达谱、真核表达载体构建和分子信息学分析

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 实验方法

5．2 结果与分析

5．2．2 猪ANK1基因生物信息学分析

5．2．3 猪ANK1基因真核表达质粒转染结果检测

5．3 讨论与小结

5．3．2 小结

结论

参考文献

附录

致谢

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