红麻转非全长HcPDIL5-2a诱导的雄性不育系内源激素的变化及TIR1基因的克隆和遗传转化

摘要

植物激素几乎调节着植物发育的每一方面，而其在雄蕊发育中的调节作用，对于雄蕊育性显得尤为重要。花药发育中植物激素的合成、运输、信号转导任何一步出现问题都将会导致雄性不育。TIR1蛋白作为信号转导过程中的一员，它对生长素的感应对于其下游依赖生长素信号的相关花药发育基因的表达举足轻重。花药发育的正常与否往往关系着植物的育性。对生长素相关基因在红麻花药发育中作用的研究，为红麻雄性不育机理研究提供了理论依据。
　　前人通过花粉管通道法，利用红麻非全长HcPDIL5-2a基因转化红麻722B保持系材料，从而获得雄性不育突变体HMS。本研究在这基础上以红麻转非全长HcPDIL5-2a基因雄性不育系HMS和722B保持系为材料，通过高效液相测定内源激素含量，分析HMS和722B内源激素的变化;采用同源克隆和分子生物学方法克隆了红麻生长素受体基因HcTIR1基因，并利用RT-qPCR的方法分析了该基因在不育系和保持系中的相对表达量;为了进一步确认HcTIR1基因在雄性不育中的作用，将HcTIR1基因构建植物超量表达载体和干扰载体，通过农杆菌介导转化烟草，验证其基因功能。获得的主要结果如下:
　　1.内源激素测定结果显示，HMS不育系中三个时期花药的IAA、GA均低于722B，而ABA的情况却与之相反。HMS不育系中IAA和GA含量的变化趋势为下降，而722B中IAA含量变化也是呈下降趋势，但其GA变化趋势为上升。两系的ABA含量变化趋势一致，但HMS不育系每个时期的ABA含量明显高于722B的相应时期。可见，非全长HcPDIL5-2a基因确实在HMS雄性不育系中对激素代谢产生了影响。
　　2.根据红麻花药转录组数据和生物信息学方法克隆了HcTIR1基因的cDNA和gDNA，它们的长度分别为1761bp和2726bp;HcTIR1基因有2个内含子，它们的长度分别为688bp、277bp，将HcTIR1基因cDNA序列提交至NCBI数据库，GenBank登陆号:KY613992;HcTIR1基因编码586个氨基酸，是富含LRR的F-box蛋白。
　　3.利用RT-qPCR技术分析了HcTIR1基因在根、茎、叶及花药不同发育时期的表达情况，结果表明，HMS系和保持系722B中HcTIR1基因在根、茎、叶表达差异不显著，而花药不同发育时期表达差异显著。在花药三个时期均显著下调，在四分体时期表达量仅为722B的0.088倍，单核期为0.116倍，双核期为0.018倍。说明非全长HcPDIL5-2a基因影响了HcTIR1础基因的表达。成功构建了HcTIR1基因的超量表达载体和RNAi干扰载体，它们可以用于研究该基因的功能。通过浓杆菌介导法，将超量表达载体和干扰载体转入烟草，从而研究HcTIR1基因的功能。目前通过普通PCR鉴定出了一批阳性苗。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 红麻概况

1．2 植物雄性不育简介

1．3 植物雄性不育内源激素调控的研究进展

1．3．1 雄性不育生长索调控的研究进展

1．3．2 雄性不育赤霉素调控的研究进展

1．3．3 雄性不育脱落酸调控的研究进展

1．4 TIR1基因的研究进展

1．5 PDI(蛋白质二硫键异构酶)的研究进展

1．5．1 PDI是一种酶——氧化还原和异构酶

1．5．2 PDI是分子伴侣

1．5．3 红麻PDI的研究进展

1．6 红麻雄性不育和转基因技术的研究进展

1．7 研究的目的意义

第二章 红麻转非全长HcPDIL5-2a诱导的雄性不育系内源激素的变化

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 仪器与试剂

2．1．3 研究内容’

2．2 实验方法

2．2．1 标准样品的配制

2．2．2 红麻内源激素的提取

2．2．3 固相萃取

2．3 结果与分析

2．3．1 色谱条件的确定

2．3．2 内源激素的定性

2．3．3 标准曲线的制备

2．3．4 分析方法的精密度

2．3．5 方法回收率的测定

2．3．6 样品的测定

2．4 小结与讨论

第三章 红麻TIR1基因的克隆和遗传转化

3．1 材料、试剂及实验器材

3．1．1 材料

3．1．2 实验器材和试剂

3．2 实验方法

3．2．1 红麻DNA和RNA的提取

3．2．2 红麻TIR1基因的克隆及生物信息学分析

3．2．3 RT-qPCR分析HcTIR1基因的相对表达量

3．2．4 HcTIR1基因超量表达载体的构建

3．2．5 红麻TIR1基因干扰载体的构建

3．2．6 农杆菌介导法转化烟草

3．3 结果与分析

3．3．1 红麻总RNA和cDNA质量检测

3．3．2 红麻TIR1基因的克隆及生物信息学分析

3．3．3 HcTIR1基因的相对表达量分析

3．3．4 HcTIR1基因超量表达载体的构建

3．3．5 HcTIR1基因干扰载体的构建

3．3．6 HcTIR1基因转化烟草

3．4 小结与讨论

3．4．3 HcTIR1基因超量表达载体和干扰载体的构建

第四章 全文结论

4．1 主要结论

4．2 创新点

4．3 问题和展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文