片形吸虫及其分泌排泄产物对巨噬细胞极化和宿主细胞免疫应答作用的研究

摘要

片形吸虫的两个致病种大片形吸虫和肝片形吸虫均能感染人和哺乳动物引起片形吸虫病，不同宿主的易感性不同，这与片形吸虫对宿主免疫应答的调控或逃避有关。肝片形吸虫及其ESP已被证实能诱导小鼠和牛巨噬细胞的M2型极化，而大片形吸虫在宿主中能否引起相似的免疫反应尚无明确的结论。本研究旨在通过体内外试验探讨大片形吸虫及其ESP在不同宿主引起的巨噬细胞极化和固有免疫反应的差异及其免疫机制，并将淋巴插管模型应用于片形吸虫ESP对宿主免疫细胞的作用研究，以探明片形吸虫及其ESP对宿主免疫应答的调控机制，为理解大片形吸虫与宿主免疫系统的相互作用提供可靠的理论基础。本研究取得以下成果:
　　1.用大片形吸虫囊蚴感染水牛、昆明小鼠(KM)和C57BL/6Nju小鼠(B6)，分别于水牛感染后4周、10周、14周和小鼠感染后3周、4周、7或8周处死。通过肝组织切片观察到水牛和小鼠肝脏均能从炎症浸润向结缔组织增生转归，水牛感染14周可见肝内肉芽组织和成虫形成。实时荧光定量PCR检测肝脏枯否细胞（巨噬细胞）分子标志和细胞因子mRNA表达量，并用ELISA检测血清IFN-γ和IL-4，结果显示:随着感染病程的加剧水牛枯否细胞表型从M2型极化向M1、M2型共上调的趋势转变，KM小鼠枯否细胞表型则由前期的M1+M2混合型向M0型转归，而B6小鼠则表现为更明显的M2型极化。结果表明:大片形吸虫感染水牛和小鼠可诱导肝脏KC表型和细胞因子的表达变化存在较大宿主差异，这些变化的宿主差异是与不同宿主肝脏的载虫能力、损伤修复能力、病变程度以及虫体在宿主体内移行、发育密切相关的。
　　2.用大片形吸虫分泌排泄产物200μg FgESP腹腔注射KM小鼠和B6小鼠，4天、7天隔日注射作为短期试验组，14周每周注射作为长期试验组，注射PBS为对照。通过肝组织切片观察到FgESP腹腔短期注射不会引起小鼠肝脏明显的组织学变化，而长期注射会导致细胞膜通透性增加、结缔组织增生和纤维化趋势。实时荧光定量PCR检测肝脏枯否细胞（巨噬细胞）分子标志和细胞因子mRNA表达量，结果显示:KM小鼠短期注射FgESP会引起肝组织iNOS mRNA表达下调，但B6小鼠CD206、Arg-2、YM-1的表达上调，两种小鼠枯否细胞均表现出M2型极化优势;两种小鼠长期注射FgESP则引起完全不同的KCs表型趋势，其中KM小鼠表现为M1和M2型同时上调的混合型，B6则表现为M1和M2均没变化的M0型。
　　3.用200μg/mL大片形吸虫分泌排泄产物FgESP体外刺激水牛原代BLMΦ和B6小鼠来源的传代iPMΦ（野生型）两类MΦ48小时。实时荧光定量PCR测定两类巨噬细胞表面分子标志和细胞因子mRNA表达量，化学法测定细胞Arg-1，Griess法测定细胞上清NO浓度，ELISA测定上清IFN-γ、IL-4浓度，结果显示:水牛BLMΦCD68基因表达下调、Arg-2基因表达上调，Arg-1、NO的合成增加，上清中的IFN-γ浓度下降、IL-4没有明显变化，提示可能存在M2型极化和细胞激活的抑制或凋亡的发生;小鼠野生型iPMΦArg-1合成增加，上清中的IL-4浓度显著升高，而IFN-γ、NO浓度没有变化，也提示M2型极化。结果表明:FgESP体外刺激不同宿主MΦ均能诱导M2型极化。
　　4.用200μg/mL FgESP分别体外刺激B6小鼠来源的基因敲除iPMΦ（MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-、TLR-2/4-/-），测定上清NO、IFN-γ、IL-4浓度和细胞裂解物的Arg-1含量，并与野生型iPMΦ进行比较，结果显示:MyD88的缺失导致IL-4的分泌与对照组无差异，而MyD88、TRIF同时缺失导致IL-4的分泌减少，两者均低于野生型iPMΦ;无论是MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-还是TLR-2/4-/-iPMΦ，FgESP体外刺激诱导的Arg-1产量均与对照组无差异。结果表明:FgESP体外刺激小鼠传代巨噬细胞能诱导依赖于MyD88及其相关通路的M2型激活，促进Th2型细胞因子分泌，促进Arg-1合成和NO分泌抑制，而TRIF和TLR2、TLR4也有可能以某种方式发挥作用。
　　5.通过外科手术成功构建绵羊的股骨前伪输入淋巴插管、肝脏输入淋巴插管，成功率分别为约70％和33％左右。
　　6.将200μg荧光标记的肝片形吸虫分泌排泄产物FhESP于绵羊股骨前区域多点皮下注射（OVA设为对照抗原），并通过股骨前伪输入淋巴插管收集0～7天不同时间点的淋巴液并分离免疫细胞，流式细胞术分析免疫细胞种类和抗原吞噬细胞的比例，荧光实时定量PCR测定巨噬细胞表面分子标志mRNA表达量，ELISA测定淋巴液的IFN-γ和IL-4，结果显示:FhESP注射刺激能使股骨前输入淋巴中的中性粒细胞、单核细胞的比例分别在注射后4～8小时和8～12小时特异性升高，淋巴细胞的比例在注射后4～8小时特异性降低，DCs的比例在注射后4～8小时升高但与OVA对照抗原相比缺乏统计学差异，嗜酸性粒细胞、巨噬细胞样细胞的比例在各时间点无明显改变;抗原吞噬细胞的数量在注射后4～12h的短暂提高，其中，嗜酸性粒细胞、单核细胞和树突状细胞对FhESP的早期吞噬具有特异性，但DCs的两个亚群的比例变化不具抗原特异性;FhESP刺激能导致淋巴液分离到的细胞M2型分子标志CD206、Arg-2和YM-1的表达均在刺激后24小时内特异性上调，淋巴液IL-4在0～8h特异性升高，IFN-γ、IL-10、IL-12的含量没有特异性变化。结果表明:绵羊股骨前伪输入淋巴插管操作简单，成功率高，适用于免疫反应动力学试验，通过该模型我们发现FhESP能在绵羊体内促进单核细胞和中性粒细胞的快速招募，提高吞噬细胞抗原吞噬能力，特异性诱导巨噬细胞M2型极化和Th2细胞因子分泌。
　　综上所述，本文认为大片形吸虫感染导致肝脏枯否细胞表型极化趋势和细胞免疫应答趋势存在较大的宿主差异，主要取决于宿主肝脏的载虫能力、损伤修复能力和病变进程。大片形吸虫分泌排泄产物FgESP则能在体、内外诱导动物宿主巨噬细胞依赖于MyD88信号通路的M2型极化，并刺激分泌Th2型细胞因子，通过上调Arg-1抑制NO分泌降低巨噬细胞清除病原的能力，可能是大片形吸虫逃避巨噬细胞免疫杀伤的策略。此外，在绵羊身上成功构建并应用伪输入淋巴插管模型研究肝片形吸虫分泌排泄产物FhESP对宿主免疫细胞的作用，发现FhESP具有早期招募中性粒细胞和单核细胞、提高吞噬细胞早期抗原吞噬、诱导M2型巨噬细胞和Th2型细胞免疫的能力。

目录

声明

摘要

图表、公式目录

缩略词表

第一篇 文献综述

引言

第一章 蠕虫感染与宿主免疫应答

1．1 抗蠕虫感染固有免疫应答概述

1．2 抗蠕虫感染的固有免疫细胞

1．3 抗蠕虫感染的病原识别受体(PRRs)

1．4 抗蠕虫感染的辅助性T细胞(Th)免疫

第二章 巨噬细胞的激活和调控与蠕虫感染

2．1 巨噬细胞的不同亚型

2．2 巨噬细胞信号通路与免疫学功能实现

2．3 巨噬细胞在蠕虫感染中的作用

第三章 片形吸虫与片形吸虫病免疫学的研究进展

3．1 片形吸虫与片形吸虫病的研究概况

3．2 片形吸虫与宿主免疫应答

3．3 片形吸虫分泌排泄产物与宿主免疫

3．4 巨噬细胞与抗片形吸虫免疫

第四章 淋巴插管模型在免疫学研究中的应用

4．1 大动物淋巴插管模型的研究进展

4．2大动物输入淋巴插管及其应用研究

第五章 本课题的目的和意义

第二篇 实验研究

第一章 大片形吸虫感染对宿主肝脏枯否细胞极化及细胞免疫应答的作用

1．1 前言

1．2 材料

1．3 方法

1．4 结果

1．5 讨论

1．6 小结

第二章 大片形吸虫分泌排泄产物对宿主巨噬细胞极化的作用及相关关键信号通路的初探

2．1 前言

2．2 材料

2．3 方法

2．4 结果

2．5 讨论

2．6小结

第三章 输入淋巴人造插管模型在片形吸虫细胞免疫研究的应用

3．1 前言

3．2 材料

3．3 方法

3．4 结果

3．5 讨论

3．6 小结

全文结论

创新点

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文