大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体表达影响的研究

摘要

Toll样受体(TLRs)参与病原相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式(DAMPs)，是固有免疫防御机制的第一道防线。寄生虫通过影响TLRs的表达和功能实现对宿主免疫应答的逃避或调控，研究大片形吸虫（Fasciola gigantica）及其分泌排泄产物(FgESP)对宿主或宿主免疫细胞TLR信号通路的作用，有助于揭示大片形吸虫早期感染固有免疫机制。
　　本试验用大片形吸虫囊蚴人工感染BALB/c和C57BL/6两个品系实验小鼠不同天数后，ELISA检测小鼠血清抗体水平的动态变化，RT-qPCR检测肝组织TLR1～9和炎症因子的转录水平变化。结果表明大片形吸虫感染两种品系小鼠能引起不同类型的肝脏局部免疫应答，BALB/c以Th1/Th2混合应答为主，C57BL/6以Th1免疫应答为主。大片形吸虫感染两种品系小鼠后均能引起肝脏TLR1～9转录水平的动态变化，TLR1、TLR6、TLR7、TLR8均显著上调表达(P＜0.05)，其中TLR6最早发生上调，可能与脂肽类分子的特异性识别相关。两种小鼠处于Th1/Th2混合免疫应答时TLR1均显著上调，表明其可能起重要作用。
　　用自然活性的FgESP(nFgESP)腹腔注射BALB/c和C57BL/6小鼠不同天数后，RT-qPCR检测小鼠肝脏TLR1～9和炎症因子的转录水平变化。结果表明nFgESP腹腔注射两种品系小鼠所致肝脏局部免疫类型倾向存在差异（BALB/c小鼠倾向于Th2，C57BL/6小鼠倾向于Th1型）;FgESP能诱导TLR1、TLR2、TLR8的上调表达。
　　用自然活性FgESP和热灭活的FgESP(hiFgESP)体外刺激小鼠RAW264.7传代巨噬细胞，RT-qPCR测定细胞TLR1～9和炎症因子的转录水平变化。结果表明nFgESP和hiFgESP刺激RAW264.7细胞均能引起TLR1、TLR7、TLR8的显著上调(P＜0.05)和TLR2、TLR3、TLR9的显著下调(P＜0.05)，可能与FgESP中非活性酶类物质相关;TLR4、TLR6在FgESP热灭活后无明显变化，可能与FgESP中活性酶类物质相关。
　　综合比较FgESP体内、外刺激和大片形吸虫囊蚴人工感染小鼠后TLR1～9转录水平的变化，发现TLR1、TLR8基因水平均显著上调，推测TLR1、TLR8在大片形吸虫可能通过分泌FgESP调控宿主免疫应答的过程中可能发挥重要作用。
　　本研究结果及讨论基于TLRs和细胞因子转录水平的变化，还需从蛋白水平进一步验证。对推测可能存在重要作用的TLR及其特异性蠕虫来源的配体进行筛查，深入研究宿主抗片形吸虫固有免疫机制，将为探索疫苗候选物和药物靶点提供理论依据，有助于更好的预防和控制片形吸虫病。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 片形吸虫与片形吸虫病

1．1．1 片形吸虫概述

1．1．2 片形吸虫病的流行

1．1．3 片形吸虫病防治

1．2 片形吸虫与宿主的免疫反应

1．2．1 片形吸虫感染与宿主免疫

1．2．2 片形吸虫的分泌排泄产物与宿主免疫

1．3 Toll样受体及其信号通路

1．3．1 TLR分子

1．3．2 TLR配体识别模式

1．3．3 TLR信号通路

1．3．4 TLR的功能及研究应用

1．4 TLR与宿主抗蠕虫感染及其分泌排泄产物免疫应答

1．4．1 TLR与抗蠕虫感染免疫应答

1．4．2 TLR与蠕虫分泌排泄产物的互作关系

1．5 课题的目的与意义

第二章 大片形吸虫感染对小鼠肝脏TLRs及炎症因子转录水平的影响

2．1 实验材料

2．2．1 实验对象

2．1．2 实验试剂、耗材

2．1．3 实验仪器

2．1．4 主要试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 大片形吸虫囊蚴培养

2．2．2 动物分组与感染

2．2．2 样品采集及保存

2．2．3 间接ELISA检测小鼠感染大片形吸虫抗体水平

2．2．4 Real-time qPCR测定TLRs和炎症因子mRNA相对表达量的变化

2．2．5 统计学分析

2．3 结果

2．3．1 小鼠感染大片形吸虫后血清抗体变化

2．3．2 小鼠感染大片形吸虫肝脏TLR1～9 mRNA相对表达量的变化

2．3．3 小鼠肝脏炎症因子mRNA相对表达量的变化

2．4 讨论

2．5 本章小结

第三章 大片形吸虫分泌排泄产物体内外刺激对小鼠来源TLRs及炎症因子转录水平的影响

3．1 实验材料

3．1．1 实验对象

3．1．2 实验试剂、耗材

3．1．3 实验仪器

3．1．4 主要试剂配制

3．2 实验方法

3．2．1 FgESP的制备与分析

3．2．2 nFgESP刺激小鼠体内实验

3．2．3 FgESP刺激小鼠巨噬细胞体外实验

3．2．4 Real-time qPCR测定TLRs和炎症因子mRNA相对表达量的变化

3．2．5 统计学分析

3．3 结果

3．3．1 nFgESP和hiFgESP的蛋白及蛋白酶活性的分析

3．3．2 nFgESP刺激小鼠肝脏TLRs和炎症因子mRNA相对表达量的变化

3．3．3 nFgESP和hiFgESP刺激小鼠巨噬细胞TLRs和炎症因子mRNA相对表达量的变化

3．4 讨论

3．4．1 nFgESP对小鼠肝脏TLRs转录水平的影响

3．4．2 nFgESP和hiFgESP对小鼠巨噬细胞TLRs转录水平的影响

3．4．3 nFgESP诱导小鼠来源TLRs转录水平变化的体内外差异

3．5 本章小结

全文结论

参考文献

致谢

项目资助