芒果MiSVP同源基因家族挖掘及其表达模式研究

摘要

SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)同源基因能调控植物花的形成和发育、抑制植物的开花时间。本实验以四季蜜芒（一年多次开花结果）和台农1号芒（一年开花结果一次）作为实验材料，探究SVP同源基因在芒果开花调控中的分子机制和表达模式。实验结果以下:
　　1.通过RT-PCR克隆获得四个芒果SVP同源基因的cDNA全长，分别命名为MiSVP1、MiSVP2、MiSVP3和MiSVP4。序列分析显示，四个MiSVP基因的开放阅读框(ORF)分别为675bp、657bp、684bp和591bp，分别编码225、219、228和197个氨基酸。
　　2.核苷酸同源性分析表明MiS VP3和MiSVP4同源性最高，为91％，其次是MiSVP1和MiSVP2，同源性为90％;系统发育分析表明，四个MiSVP蛋白分属二类不同植物SVP蛋白分支，其中MiSVP1、MiSVP3和MiSVP4属于同一分支，而MiSVP2在另一分支。经过比较MiSVP3和MiSVP4的同源关系最近，MiSVP1与大豆（Glycine max）的同源关系最近，MiSVP2与胡萝卜(Daucus carota subsp.Sativus)的同源关系最近。
　　3.利用实时荧光定量技术(qRT-PCR)分析MiSVP1、MiSVP2、MiSVP3、MiSVP4在芒果不同组织和芒果花芽分化期到开花这段时期的表达模式，以及多效唑、2℃低温、干旱、盐胁迫等处理后，4个芒果MiSVP基因在的表达情况。
　　(1)MiSVP1、MiSVP2、MiSVP3和MiSVP4基因在四季蜜芒和台农1号芒成年树的茎叶花以及芒果幼树的叶中均有表达。在四季蜜芒中，这4个芒果MiSVP基因在芒果成熟叶片中的表达水平最高，其次是茎和10个月龄幼树的叶片，在芒果花中的表达水平最低;在台农1号芒中，在10个月龄幼树的叶片中表达水平最高，其次是成熟芒果茎和叶中，在芒果花中的表达水平最低。4个MiSVP基因的表达水平相比较发现，MiSVP3在台农1号芒和四季蜜芒果中的表达量明显高于其他基因，MiSVP4基因的表达量极低。
　　(2)对MiSVP1、MiSVP2、MiSVP3和MiSVP4基因在一般芒果花芽分化期到开花这段时期进行表达分析，这4个芒果MiSVP基因在四季蜜芒和台农1号的叶中的表达量均于十二月份达到峰值，其次是二月份。4个基因的表达水平比较发现，MiSVP3在台农和四季蜜芒果中的表达量明显高于其他基因，MiSVP4基因的表达量极低。
　　(3)用1000ppm浓度的多效唑处理四季蜜芒，4个芒果MiSVP基因在叶片和花中的表达水平对比对照组有所降低，在茎中的表达水平比对照组明显提高。
　　(4)2℃、30％PEG和300mmol/L NaCl分别处理四季蜜芒10个月生长的幼树，MiSVP4基因的表达水平几乎为零，并且处理后和对照组的比较变化不大。2℃低温处理后MiSVP1、MiSVP2、MiSVP3基因的表达水平均有所升高，并且在对抗低温的响应过程具有一定的持续性。30％PEG处理0～72h的过程中MiSVP1和MiSVP2基因的表达量始终高于对照，MiSVP3基因在48h之后表达水平低于对照。300mmol/L NaCl处理后MiSVP3的表达始终高于其他基因，所有基因在抗盐的过程中均随着时间的延长功能降低。
　　4.构建4个芒果MiSVP基因的真核表达载体pBI121-MiSVP-GUS，分别提取质粒转入农杆菌内。

目录

声明

摘要

文章中出现的缩略词及其中英全称

1．1 概述

1．2 植物开花相关基因的研究进展

1．3 植物开花抑制基因SVP的研究进展

1．3．1 植物SVP基因的结构

1．3．2 植物SVP同源基因的功能及表达

1．3．3 SVP基因与其他基因的互作

1．4 研究目的与意义

1．5 技术路线

2．1 实验材料

2．1．1 样品材料

2．1．2 试剂药品及配置

2．1．3 载体与菌株

2．1．4 引物

2．2 实验仪器与器材

2．3 实验方法

2．3．1 RNA提取与cDNA合成

2．3．2 DNA的提取

2．3．3 MiSVP基因cDNA全长克隆

2．3．4 MiSVP基因胶回收

2．3．5 胶回收产物与载体连接转化

2．3．6 基因的生物信息学分析

2．3．7 实时荧光定量表达分析

2．3．8 表达载体的构建

2．3．9 转化农杆菌

2．3．10 拟南芥的种植与根癌农杆菌介导转化拟南芥

3 结果与分析

3．1 芒果总RNA提取与cDNA合成

3．2 MiSVPs同源基因克隆

3．3 生物信息学分析

3．3．1 氨基酸序列分析和蛋白质理化性质分析

3．3．2 蛋白质二级结构和三级结构

3．3．3 氨基酸序列同源性比对和进化分析

3．4 MiSVP基因表达模式分析

3．4．1 组织器官中的表达分析

3．4．2 时间表达分析

3．4．3 多效唑处理表达分析

3．4．4 逆境处理表达分析

3．5 真核表达载体构建

3．5．1 构建表达载体

3．5．2 农杆菌转化

4．1 讨论

4．1．1 基因克隆与生物信息学分析

4．1．2 基因表达模式分析

4．1．3 基因表达载体构建

4．2 结论

4．2．1 基因克隆与生物信息学分析

4．2．2 荧光定量

4．2．3 基因表达载体构建

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况