基于CRISPR/Cas9的水稻ALOG家族成员基因敲除突变体的构建及其成员G1L6的调控网络的研究

摘要

ALOG(Arabidopsis LSH1and Oryza G1)基因家族成员广泛存在于陆生植物中，并在其生长发育的过程中起到关键的作用。在水稻中ALOG基因家族共有10个成员（G1，G1L1～G1L9）。其中三个成员(G1，G1L5和G1L6)的功能已被研究，它们都参与了水稻花发育的过程，而其它7个成员的功能尚属未知。本项目主要关注水稻功能未知的7个ALOG基因和已经报道过的G1L6基因，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建它们的基因敲除株系，并进一步地构建基因过表达株系，以此来研究它们的基因功能。
　　观察发现，所有的基因家族成员过表达株系都没有明显的发育缺陷表型，而大多数的家族成员的基因敲除株系也没有明显的发育缺陷表型（G1L1和G1L2的基因敲除株系除外）。考虑到这些基因家族成员之间序列有相似性，这种家族内单基因突变未出现缺陷表型的原因可能跟他们之间功能冗余性有关。G1L6转基因敲除植株表型跟之前报道过的内外稃变窄，呈现“鸟嘴”状的表型很相似，但是其纯合植株表现出明显的不育性状。G1L1和G1L2的转基因敲除株系表现出穗发育缺陷的表型，具体表现为主穗轴变长，而且上面的小穗变少。在转录组KEGG富集通路分析中，我们找到了8个和水稻淀粉、蔗糖生物合成途径相关基因得到差异表达，这可能跟KO-g1l6灌浆失败有关;另外，15个和水稻植物激素信号转导途径相关的基因得到差异表达，揭示着植物激素可能在G1L6介导的水稻内外稃发育的过程中扮演着重要的角色。本研究中，我们运用分子生物学技术，通过RNA-Seq基因组学技术来研究G1L6的调控网络。通过该项目的研究，我们构建了ALOG家族成员的基因敲除株和过表达株，为今后进一步地研究ALOG家族成员提供了关键的遗传材料，同时，通过对G1L6调控网络的研究，可以进一步了解水稻内外稃发育的分子生物学机制。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 水稻ALOG基因家族研究概况

1．2 ALOG转录因子的研究进展

1．2．1 转录因子的简介

1．2．2 ALOG转录因子起源和结构

1．3 拟南芥中ALOG基因家族研究进展

1．4 水稻中ALOG基因家族研究进展

1．5 水稻ALOG基因研究的目的和意义

1．6 技术路线

2．1 实验材料

2．1．1 研究材料

2．1．2 引物合成与测序

2．1．3 菌株与质粒

2．1．4 实验用酶

2．1．5 实验用试剂

2．1．6 实验仪器

2．2 实验方法与步骤

2．2．1 水稻ALOG家族CRISPR／Cas9转基因敲除载体的构建

2．2．2 水稻ALOG家族过表达载体的构建

2．2．3 大肠杆菌E．Coli转化实验

2．2．4 质粒DNA提取

2．2．5 温室种植和取材

2．2．6 TPS简易法抽提植物基因组DNA

2．2．7 幼穗期RNA的提取

2．2．8 反转录PCR反应

2．2．9 qRT-PCR反应

2．3 RNA-Seq转录组数据分析

2．3．1 转录组测序实验流程

2．3．2 RNA样品检测

2．3．3 文库构建

2．3．4 文库质控

2．3．5 上机测序

2．4 生物信息学分析

2．4．1 生物信息学分析流程概括

2．4．2 测序数据及其质量控制

2．4．3 转录组数据与参考基因组序列比对

2．4．4 基因表达量分析

2．4．5 差异表达分析

2．4．6 差异表达筛选

2．5 差异表达基因功能注释和富集分析

2．5．1 差异表达基因GO分类

2．5．2 差异表达基因GO富集层次分析

2．5．5 差异表达基因KEGG通路富集分析

2．5．6 差异表达基因蛋白互作网络

2．5．7 qRT-PCR验证

2．6 新基因的发掘与功能注释

2．6．2 新基因的功能注释

第三章 结果与分析

3．1 转基因敲除水稻植株的构建

3．1．1 敲除靶位点的选择

3．1．2 sgRNA表达盒的构建

3．2 过表达水稻植株的构建

3．3 转基因植株的获得

3．4 缺失突变体的鉴定

3．5 转基因植株的表型分析

3．6 RNA样品制备与质量检测

3．7 转录组数据分析

3．7．1 测序数据及其质量控制

3．7．2 转录组数据与参考基因组序列比对

3．7．3 差异表达分析

3．8 转录组数据的qPcR验证

第四章 讨论

4．1 CRISPR／Cas9技术对本实验研究的意义

4．2 RNA-Seq研究影响水稻形态发育机制

4．3 G1L6与已知控制水稻内外稃发育的基因的关系

4．4 GIL6通过影响水稻淀粉和蔗糖相关基因来影响水稻育性

4．5 G1L6影响水稻植物激素信号转导途径相关基因的差异表达

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表论文情况