改造启动子和分泌途径提高重组毕赤酵母β-呋喃果糖苷酶分泌

摘要

低聚果糖特别是新低聚果糖(neo-FOS)是具有益生元功效的保健型低聚糖类，而产生neo-FOS的β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase，β-Ffase)是其大规模生产瓶颈所在。为了提高β-Ffase产量，本研究应用强启动子构建、转录因子过表达和分泌途径改造等策略以促进毕赤酵母(Pichia pastoris高效分泌β-Ffase。首先，通过截短毕赤酵母3-磷酸甘油酸激酶启动子(PPGK1)序列和增加转录因子(AFT1)结合位点构建了系列组成型强启动子:PPE、PPD、PPD1、PPD2、PPD5，并利用报告基因egfp对这些启动子进行强度表征。利用这些强启动子调控来源于草酸青霉的β-Ffase基因(PoFF32A)分泌表达，构建系列毕赤酵母重组菌G/PE-BF、G/PD-BF、G/PD1-BF、G/PD2-BF、G/PD5-BF，其胞外β-Ffase酶活较对照菌(G/PGK1-BF)分别提高了29.9％、32.0％、43.3％、45.4％、57.7％，但均约有20％的β-Ffase酶活残余胞内。其次，重组菌过表达转录因子AFT1后，G/AFT1-PE-BF、G/AFT1-PD5-BF胞外酶活分别提高了135.5％、98.5％。最后，为了进一步提高G/PE-BF的β-Ffase产量，对分泌途径的HA C1、PDI1、SEC4、SED5基因分别进行过表达，重组菌胞外酶活分别提高了113.4％、121.1％、16.7％、15.7％。构建的重组菌G/PDI1-PE-BF，摇瓶发酵60h，胞外酶活最高可到27.0U/mL，较对照G/PGK1-BF的提高了187.2％。因此，本研究为FOS的商业化生产奠定了一定基础，也为提高毕赤酵母的β-Ffase分泌表达提供基因工程改造思路。

目录

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摘要

第一章 前言

1．1．2 β-呋喃果糖苷酶(β-Ffase)来源和应用

1．1．3 利用毕赤酵母分泌表达β-呋喃果糖昔酶

1．2 毕赤酵母外源蛋白高效表达策略

1．2．1 应用代谢工程提高外源蛋白产量

1．2．2 启动子工程

1．2．3 基于调控元件的基因表达调控

1．2．4 改造分泌途径提高外源蛋白产量

1．3 课题目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 引物序列

2．1．3 工具酶

2．1．4 抗生素

2．1．5 培养基

2．1．6 溶液

2．2 方法

2．2．1 质粒提取

2．2．2 DNA酶切、DNA纯化和连接

2．2．3 重组载体转化大肠杆菌感受态细胞

2．2．5 重组质粒电转P.pastoris GS115感受态细胞

2．2．6 重组毕赤酵母的yEGFP测定

2．2．7 重组蛋白AFT1p1-156分离纯化

2．2．8 凝胶电泳迁移实验(EMSA)

2．2．10 重组毕赤酵母的β-Ffase酶活测定

2．2．11 重组毕赤酵母干重DCW与OD600的关系曲线

2．2．12 毕赤酵母重组菌的总RNA提取

2．2．13 看家基因GAP和目的基因的RT-PCR标准曲线

第三章 结果与讨论

3．1．1 毕赤酵母组成型强启动子构建与强度表征

3．1．2 增加转录因子结合位点提高启动子强度

3．1．3 EMSA验证启动子含AFT1p结合位点

3．1．4 利用强启动子调控β-呋喃果糖苷酶基因表达

小结

3．2．1 过表达转录因子AFT1重组菌构建

3．2．2 过表达转录因子AFT1对β-呋喃果糖苷酶分泌的影响

小结

3．3．2 表达分泌途径相关基因重组菌的构建

3．3．3 分泌途径相关基因对β-呋喃果糖苷酶分泌影响

小结

第四章 总结与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文和发明专利情况