热休克蛋白72多克隆抗体的制备和检测

摘要

【目的】本课题拟构建一个IPTG诱导的、在大肠杆菌DH5α中能高效表达人HSP72的原核载体,用此载体高效表达HSP72,将获得的高纯HSP72免疫新西兰大白兔,制备抗HSP72多克隆抗体.【方法】从质粒pH2.3获取HSP72 cDNA,克隆至原核表达载体pPROEX-1<'TM>中,并通过酶切和DNA测序鉴定pEX-HSP72重组体;IPTG诱导pEX-HSP72重组质粒在DH5α中表达目的蛋白HSP72,并用Western blot对其进行检测;用纯化后的重组HSP72免疫新西兰大白兔,用Western blot检测获得的抗HSP72的多克隆抗体对原核和真核细胞内表达的HSP72的特异性和灵敏度.【结果】1.鉴定pEX-HSP72重组质粒:用EcoR I和Hind Ⅲ双酶切重组质粒,电泳分离出4.7kb和2.4kb的两条带,DNA测序后Blast软件比对证实pEX-HSP72重组质粒携带编码人类HSP72的cDNA序列;2.IPTG能诱导pEX-HSP72重组质粒表达HSP72,IPTG的浓度在0.4~2 mM,诱导效果无明显差异;3.抗HSP72多克隆抗体抗血清的检测:抗HSP72多克隆抗体稀释100,000倍时,能够特异的检测出20 ng以上的细菌表达的HSP72;在按1:10,000稀释时,能够特异地检测出经热处理后Hela和N18细胞表达的HSP72.【结论】成功构建了HSP72原核表达载体,HSP72原核表达载体能够被IPTG特异性的严紧在DH5α中诱导表达,用HSP72原核表达载体制备的HSP72作为抗原制备出高特异性和高灵敏度的抗HSP72多克隆抗体,该抗体能特异性地检测热诱导表达的人和鼠HSP72.

目录

文摘

英文文摘

缩略表

引 言

第一章pEX-HSP72载体构建

1.前言

2.材料与方法

3.结果与分析

4.小结

第二章HSP72在原核细胞中的表达

1.前言

2.材料与方法

3.结果与分析

4.小结

第三章HSP72多克隆抗体有效性的检测

1.前言

2.材料与方法

3.结果与分析

4.小结

第四章讨论

第五章结论

参考文献

附图1

附图2

致 谢

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