使用热休克蛋白72作为敏感生物标志物来检测急性肾损伤的诊断方法

摘要

本发明涉及一种通过测量尿样中的生物标志物浓度来检测早期急性肾衰竭的可靠的、容易进行的非侵入性诊断方法，所述生物标志物选自70KDa家族的热休克蛋白。更具体地，本发明涉及热休克蛋白72的鉴定，其中所述生物标志物通过ELISA和蛋白质印迹法或通过使用实时RT-PCR在mRNA水平进行鉴定。本发明有助于解决现存于医药领域中的问题，即不能在早期阶段检测急性肾衰竭或检测肾损伤的严重性，从而及时以有效疗法来治疗患者。

说明书

说明书

发明领域

本发明涉及临床医药领域并且涉及用于检测急性肾损伤(Acute  Kidney Injury，AKI)的诊断方法，更具体地涉及证实72kDa的热休克蛋白 (Hsp72)是一种检测AKI的非侵入性的、敏感的和早期生物标志物，并且 涉及检测尿样中的Hsp72的定量方法。

背景技术

急性肾损伤是在由于不同原因住院的患者中发病率和死亡率的一种 重要的原因。据估计，AKI发病率的变化从在任何外科手术前具有正常肾 功能的患者中的5％到进入重症监护病房(ICU)的患者中的30％。尽管最近 在诊断和治疗上有了发展，AKI相关的发病率和死亡率仍旧保持高度升高 (在ICU中的患者中为40％-60％)并且在过去四十年里没有显著改善，这主 要是由于可用于早期检测AKI的工具缺乏敏感性和特异性(Clin J Am Soc  Nephrol(美国肾脏学学会临床杂志)3：1895-1901，2088)。因为这样，寻找 早期生物标志物越来越受到重视。而且，这些新的生物标志物可能是用于 早期检测AKI的潜在工具，并且也可以用于区分不同程度的肾损伤，从而 确定检测由于严重的AKI发作而有风险发展慢性肾疾病的患者。因此，开 发有效的生物标志物将有助于在暴露于AKI的那些患者中(如进入ICU 的患者，将进行心脏外科手术的患者，肾移植患者或已经发展AKI的患者) 中对于充分治疗AKI进行适当的干预，该生物标志物将有助于对损伤进行 分级，并且检测具有慢性肾疾病发展风险的那些患者。

在临床实践中，AKI诊断的确定是基于血清肌酸酐的升高并且通过评 估肾小球滤过率(GFR)进行。尽管血清肌酸酐用于在慢性肾疾病患者中、 在AKI患者中进行肾功能评估，但是，因为以下三点原因它并不是一个好 的指示剂：1)大量肾组织可能被损伤，但不伴随血清肌酸酐升高，在肾 移植供体中存在明显的实例，其失去50％的肾实质，并且在血清肌酸酐水 平中并不存在任何变化，2)血清肌酸酐浓度取决于许多非肾因素，如在骨 骼肌中肌酸转化为肌酸酐，肌酸酐释放到血液中等，因此取决于其释放和 累积，血清肌酸酐的升高以滞后形式发生，和3)血清肌酸酐可能被其它 因素影响，如被体重、人种、性别、年龄、药物消耗、肌肉代谢和蛋白摄 取影响。关于GFR测定，这可能关于肾和非肾损伤而被改变。例如，血 容量不足(hypovolemia)或在传入小动脉中血管收缩或血管舒张程度的改 变导致TGF的减少，伴随随后发生的血清肌酸酐升高，这与肾小管或肾 损伤(tubular or renal injury)并不相关。所有这些因素使发展AKI的患者的 早期干预难以进行，并且后果是不能达到更好的预后。(Clin Transl Sci 3；200-208；2008).

生物标志物是一种生物分子，其内源性产生并且可能是用于检测异常 生物学过程的客观指示物。此外，其可以有助于检测药理干预是否可用于 减少由病理过程导致的损伤。

具体而言，在AKI患者中，有用的生物标志物是这样的一种生物标记 物，其有助于以早期、精确和容易的方式检测AKI的主要结构并发症，其 是急性肾小管坏死(acute tubular necrosis，ATN)。ATN的特征在于由于刷 状缘损失和上皮的极性导致的严重的近端肾小管损伤。对于这些特征，可 以找到这样的生物标志物，所述生物标志物可以在脱附细胞中被检测到， 并且会在尿中出现，由此反映与该综合征相关的肾小管损伤。

所述生物标志物不仅有助于区分ATN和其它类型的肾损伤，还可以 潜在地鉴定肾小管损伤定位、损伤的原因和短暂干扰(temporal curse)。

一些研究提出了用于ATN检测的蛋白和生物化学标志物，在它们中 有：N-乙酰基-b-D-氨基葡糖苷酶(N-acetil-b-D-glucosaminidasa，NAG)，嗜 中性白细胞明胶酶相关的脂笼蛋白(Neutrophil gelatinase associated  lipocalin，NGAL)，肾损伤分子-1(Kim-1)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和白 细胞介素-18(IL-18)(Am J Physiol Renal Physiol(美国生理学肾脏学杂志) 290：F517-F529)(J Am Soc Nephrol(美国肾脏学学会杂志)18：904-912，2007) (Am J of Tranplantation(美国移植杂志)6：1639-1645；2006)。在最近关于90 名进行了心脏外科手术的患者的报道中，评估了Kim-1、NAG和NGAL 的诊断应用性。通过使用评分等级1，以即时方式或在心脏外科手术后3 小时分析这些分子用于AKI检测的能力，发现Kim-1的能力分别是0.68 和0.65，NAG的能力分别是0.61和0.63，并且NGAL的能力分别是0.59 和0.65。为了增加这些标志物的敏感性，有必要组合定量它们，并且以这 种方式，将AKI的敏感性和早期检测分别增加到0.75和0.78(Clin JAm Soc  Nephrol(美国肾脏学学会杂志)5；873-882，2009)。这支持了这一观点，即 必须继续寻找具有更高的用于早期诊断的潜力并且具有对AKI损伤分级 能力的新型生物标志物。

据报道，在AKI现象过程中，激活了一些补偿所产生的细胞应激的机 制，其中之一是热休克蛋白家族(Hsp)表达的增加(Experientia 18， 571-573，1962)，其有助于恢复细胞稳态。这些蛋白属于多基因家族，其分 子量从10到150kDa。根据它们的分子量，这些蛋白被分类在6个亚家族 中：100-110kDa，90kDa，70kDa，60kDa，40kDa和分子量在18和30kDa 之间的Hsp亚家族(Ann Med.4：261-71，1999)。

具体而言，Hsp70家族由4个同种型组成：Grp78，mHsp95，Hsc70和 可诱导的同种型Hsp72。后者在细胞应激后表达并且其诱导可以高达总细 胞蛋白的15％(Cell stress chaperones(细胞应激分子伴侣)4；309-316，2003)。 这一事实，与在AKI过程中发生的肾单位的近侧肾小管的细胞脱附一起被 用作本发明的基础，即：使用免疫测定法在蛋白水平和使用实时-聚合酶链 式反应(实时PCR)在mRNA水平检测作为AKI的敏感生物标志物的尿 Hsp72。

已经将ELISA(酶联免疫吸附测定法)技术和蛋白质印迹分析广泛用于 在不同类型的样品中使用抗体来检测特异性蛋白(Immunology 6^thedition(免疫学，第6版)，2007)。将实时PCR测试用于具体基因的mRNA 水平的定量测定。

本发明有助于解决临床实践中存在的问题(即不能早期检测AKI和不 能对肾脏遭受的肾损伤的程度进行分级)，从而以有效疗法对患者进行适 当干预。

发明描述

本发明涉及通过使用尿样中的生物标志物Hsp72的浓度早期检测急 性肾损伤的非侵入性诊断方法。这是一种非侵入性、可靠的和容易的方法。

在本发明中，用于检测AKI的方法通过从哺乳动物(优选人)获得尿样 和在蛋白和mRNA水平定量生物标志物浓度进行，所述生物标志物为热 休克蛋白72(Hsp72)。

生物标志物浓度可以使用免疫测定法如ELISA和蛋白质印迹法(它们 不限制本发明)在mRNA水平和/或蛋白水平进行测定。

与对照值相比，来自生物标志物定量的结果在40倍和533倍之间变 化，并且这种增加取决于损伤强度，在尿中的生物标志物Hsp72可以自在 肾中引起损伤后的三小时起检测到。

Hsp72定量能够对由局部缺血(ischemia)的时期延长而引起的损伤 的强度进行分级，这对于临床实践是重要的，从而可以检测遭受严重肾损 伤的那些患者，这又允许进行适当的随访并且因此这是有重大意义的，原 因在于其可以避免或减少慢性肾疾病并发症。

实施例

下面的实施例举例说明本发明，并且决不对其有限制。

实施例1.为了证实Hsp72作为AKI的敏感和早期生物标志物的应用， 我们使用了大鼠中的肾局部缺血/再灌注(I/R)模型。

局部缺血/再灌注模型：整个研究中一直使用雄性Wistar大鼠。将大 鼠用戊巴比妥钠(30mg/kg i.p.)进行麻醉，进行剖腹手术，切开肾蒂，其后 通过夹住两条动脉历时10，20，30，45和60分钟来中断到肾中的血流，目 的是评估肾损伤的不同程度，从低度肾损伤到中度肾损伤到严重肾损伤。 此外，包括进行了假外科手术(false surgery)的组作为对照。每组包括6只 大鼠。在局部缺血时期结束时，将大鼠缝合并且容许进行肾再灌注24小 时。为了确定定量Hsp72 mRNA水平作为生物标志物的应用性，使用36 只大鼠，将其分到6个组中；使对照组和大鼠进行10，20，30，45和60分 钟的双侧局部缺血，将它们都进行24小时的再灌注。用特定条件收集尿 以避免mRNA降解，如下所述。

以类似方式，并且为了确定蛋白Hsp72水平的定量作为早期生物标志 物的应用，将另外33只大鼠分到11个组中：进行假外科手术的对照组， 进行了30分钟双侧局部缺血和3，6，9，12，18，24，48，72，96和120小时再 灌注时期的大鼠。收集尿，使用ELISA方法来确定Hsp72蛋白水平作为 AKI的早期生物标志物的敏感性。

在所有的组中，通过肌酸酐清除率并且通过测量肾血流来评估肾功 能。使用光学显微镜和形态测量法来评估结构损伤。作为肾小管损伤标志 物，测量尿NAG和总蛋白水平。为了研究Hsp72是否在肾中的局部缺血 过程中被诱导，评估在肾组织提取物中的Hsp72的mRNA和蛋白水平。 为了确定Hsp72是否是检测不同程度肾损伤的敏感和早期生物标志物，使 用ELISA和蛋白质印迹法来定量尿Hsp72水平。

实施例2.通过使用实时PCR进行Hsp72检测

对于Hsp72 mRNA水平检测，将进行30分钟的双侧局部缺血的30 只雄性Wistar大鼠分为6组：进行假外科手术(对照组)的大鼠和进行10，20， 30，45和60分钟的双侧局部缺血和24小时的再灌注的大鼠。外科手术后 一小时，将大鼠置于代谢笼中24小时。代谢笼之前用RNA酶抑制剂 (RNAse Zap，Ambion)处理。在历时24小时收集尿液的管中，加入300μl RNA later(Ambion)，将样品以3000rpm离心30分钟。在磷酸盐缓冲液 pH＝7.4中重新悬浮尿的沉降物并且再次以13000 rpm离心3分钟。按照生 产商(Invitrogen)提供的Trizol方法进行总RNA提取。通过260 nm处的UV 吸光度确定RNA浓度，并且通过1％琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整性。 在60分钟内，在37℃使用逆转录酶反应(RT)从1μg RNA合成每种cDNA。 通过实时PCR检测Hsp72 mRNA水平。包括核糖体RNA 18S作为对照基 因来校正扩增效率变化。

实施例3.通过使用ELISA检测Hsp72

关于Hsp72蛋白水平检测，包括36只大鼠并且进行10，20，30，45和 60分钟的双侧局部缺血。外科手术后一小时，将大鼠置于代谢笼中24小 时并且收集尿。尿必须立即用于ELISA或蛋白质印迹测定法，不然必须在 -80℃保存以避免Hsp72降解。关于通过ELISA定量Hsp72，使用由 Stressgene生产的商购试剂盒Hsp70高敏感性ELISA试剂盒，简要解释如 下：

1)将100μl尿样加入ELISA板的每个孔中；

2)将该板在室温温育2小时，并且伴随轻柔摇动；

3)在每个孔中必须用由该试剂盒提供的洗涤缓冲液进行三次洗涤；

4)必须将100μl一级抗体(抗-Hsp72)加入孔中，并且将板温育60分钟。 在该时期结束的时候，必须如第三点提及进行三次洗涤；

5)必须加入100μl与HRP偶联的二级抗体，并且再次在室温温育60 分钟。在该时间结束的时候，必须再进行三次洗涤；

6)必须将100μl底物溶液(来自该试剂盒)加入每个孔中，并且必须在 室温温育所述板30分钟；

7)必须加入100μl终止溶液(来自该试剂盒)；

8)必须如生产商指示在450nm读取所述板。

实施例4.使用蛋白质印迹法来检测Hsp72

使用来自在上一实施例中所述大鼠的相同的尿样。必须将每份尿 1∶100稀释，并且仅使用10μl的稀释的尿。将稀释的尿与10μl上样缓冲液 (6％SDS，15％甘油，150mM Tris，3％溴酚蓝，2％ β-巯基乙醇，pH 7.6)混 合。将蛋白在95℃变性5分钟，在8.5％ SDS-PAGE凝胶中电泳分离，并 且在9V在60分钟内，在转移印迹(SD cell，BioRad)中电印迹到预先在1X 迁移缓冲液(190mM甘氨酸，2mM Tris碱，SDS 0.1％，200mL甲醇)中平衡 的聚二氟乙烯(polivinil difluoride)膜(PVDF，Amersham Pharmacia Biotech， Psicataway，NJ，USA)上，并且在室温，用5％封闭试剂(BIORAD)在TBS-T (Tris缓冲盐水和吐温)中进行封闭。在封闭步骤后，将膜在4℃用抗-Hsp72 一级抗体1∶5000(Stressgene)温育。温育后，将膜洗涤用TBS-T三次，每次 洗涤10分钟。随后，将1∶5000的与过氧化物酶缀合的IgG山羊抗-小鼠二 级抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc)与膜在室温温育90分钟，并且将膜 再次洗涤6次。使用商购的试剂盒ECL plus(GE卫生保健生命科学(GE  Healthcare Life Sciences))检测Hsp72的量，并且扫描获得的条带进行光 密度分析。

结果

首先，我们评估了产生不同时期的双侧局部缺血(10-60分钟)和24小 时的再灌注对肾功能的影响。五组大鼠经历了局部缺血，发展了肾功能不 全，由血清肌酸酐的进行性升高和通过肌酸酐清除率测量的GFR的减少 证实，如在图1A和1B中所显示。肾功能不全与10到30％的肾血流减少 相关，不伴随平均动脉压的变化，如在图1C和1D中详细显示。

光学显微镜研究揭示，不同的双侧局部缺血时期和24小时的再灌注 诱导了与引起的局部缺血时间相应的不同程度的肾小管损伤，如在图2的 (A)到(F)每组的代表性图象中所显示。损伤的特征在于刷状缘的损失、肾 小管扩张、细胞脱附和管型形成。在图2G和2H中显示的每个视野内的 管型数目和受影响的肾小管区域百分比分析，揭示局部缺血的时期越长， 发展的肾小管损伤程度越大，这意味着存在肾小管损伤和管型数目的进行 性增加，所述肾小管损伤和管型数目的进行性增加与损伤的强度成比例。 通过光学显微镜评估的组织学损伤是确定由局部缺血/再灌注诱导的损伤 程度的黄金标准，这是为什么在下幅图中我们将显示在Hsp72生物标志物 和肾小管损伤之间的相关性的原因。

评估了肾小管损伤和氧化应激的一些经典标志物，如尿蛋白排泄、N- 乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶(NAG)和H₂O₂。如在图3A中所显示，NAG升 高仅在局部缺血30分钟后具有统计学意义，这意味着这种标志物不能鉴 定由更短时期局部缺血(10或20分钟)诱导的肾损伤。关于氧化应激标志 物，H₂O₂尿排泄从局部缺血10分钟开始升高，但是敏感性并不足以区分 不同程度的局部缺血，尤其是20分钟和60分钟之间的局部缺血，见图3B。 最终，我们观察到蛋白尿是检测不同程度肾损伤的最佳标志物，如在图3C 中所显示。

为了评估Hsp72是否在不同时期的局部缺血过程中在肾组织中被诱 导，确定肾组织中的Hsp72 mRNA和蛋白质水平，这意味着一旦收集了尿， 即处死大鼠并且取一个肾进行mRNA和蛋白提取。如在图4A和4B中显 示，在来自具有I/R的组的每只大鼠的肾组织中，Hsp72 mRNA和蛋白水 平都显著增加。此外，要理解其进行性增加明显限制了由不同时期的局部 缺血/再灌注诱导的肾损伤的不同程度。这些结果显示在I/R现象中，Hsp72 表达的增加与诱导的损伤的程度成比例，这是令人感兴趣的并且有利于本 发明。

利用这些数据，我们决定研究该蛋白质是否能够在遭受肾局部缺血/ 再灌注损伤的大鼠的尿中被检测到用以开发敏感的和非侵入性的方法。为 此目的，我们通过使用两种免疫测定法确定Hsp72水平。第一种方法通过 ELISA进行，第二个方法通过蛋白质印迹分析进行。通过ELISA定量尿 的Hsp72揭示这种蛋白是一种优越的用于AKI的生物标志物，因为其能 够白10分钟的局部缺血起在尿中被检测到，并且显示与对照相比，与由 局部缺血诱导的肾损伤的程度相应的进行性增加在经历60分钟的局部缺 血的大鼠中达到25倍的诱导，如在图4C中显示。这些生物标志物的进行 性升高明显与关于局部缺血损伤的黄金标准，即组织病理学分析相关。图 5A显示在尿中的Hsp72的量与管型形成之间的正相关性，其相关性为 0.83，p＜0.0001，并且图5B显示在尿Hsp72与受影响的区域的百分比之间 的相关性，其为0.79并且p＜0.0001。

我们用来检测hsp72蛋白水平的其它策略是对来自不同组的尿样进行 蛋白质印迹分析。图6A中的上图描述了来自蛋白质印迹分析的放射自显 影，而下图显示了扫描的条带的光密度分析。如可以观察到的，I/R在经 历了不同时期的局部缺血的大鼠中诱导了尿Hsp72水平的显著增加。类似 于ELISA分析，自10分钟局部缺血起，Hsp72的检测具有统计学显著性， 并且其与诱导的肾损伤的程度成比例升高。与ELISA相比，使用蛋白质印 迹法检测不同程度的肾损伤的敏感性更高，因为在10分钟组中Hsp72增 加是40倍，逐渐增加，在具有60分钟的严重肾损伤的组中达到535倍。 在尿中的Hsp72的量与管型形成之间的相关性显示在图6B中，其是0.9476， p＜0.0001。这些结果证实，尿Hsp72检测的敏感性足以检测不同程度的肾 损伤，然而通过蛋白质印迹分析检测这种蛋白优于ELISA分析(见相关性)。 此外，重要的是强调使用蛋白质印迹分析，其仅需要0.1μl的尿，而使用 ELISA，其则需要100μl的尿。

为了研究Hsp72检测是否不仅仅限于蛋白水平的定量，我们决定研究 在经历局部缺血的大鼠尿中的Hsp72 mRNA丰度。提取的RNA的完整性 显示在图7A中。与对照组相比，在经历了局部缺血的大鼠中，尿的Hsp72 mRNA水平增加，如在图7B中显示。如在蛋白质水平上发生的那样，在 尿中的mRNA水平与诱导的损伤的程度成比例增加。这用黄金标准进行 了证实，并且如在图7C中显示，在Hsp72 mRNA水平和每视野的管型数 目之间的显著相关性为0.8509。

最后，为了评估Hsp72作为AKI的早期生物标志物的应用性，在经 历了30分钟局部缺血和3-120小时再灌注时期的大鼠中确定尿的Hsp72 浓度。图8显示与肾小管损伤的其它标志物相比的Hsp72检测。如在图 8C中显示，自早期时期(3小时的再灌注)观察到Hsp72的显著升高，在18 小时的再灌注达到峰值，随后这种蛋白在尿中的排泄减少，这与72小时 后肾小管的再生作用相关。这些结果显示Hsp72作为AKI检测的早期生 物标志物的应用性。

此外，与对照组相比，来自生物标志物定量的结果更大，并且观察到 的增加取决于损伤强度，该结果是使用三种不同方法观察到的。重要的是 强调能够自肾损伤被诱导后的前三个小时起检测到尿的Hsp72。

实施例5.在健康活肾供体和在AKI患者中的尿Hsp72水平。

收集来自5名健康肾供体(对照)和9名来自在Instituto Nacional de  Ciencias Médicas y Nutrición，Salvador Zubirán的ICU的败血症性AKI患者 的样品。根据AKIN(Acute Kidney Injury Network(急性肾损伤网络))指南， 通过与基础相比，血清肌酸酐0.3mg/dl以上的增加来确定AKI的诊断。 在健康供体中，收集肾切除术(知情同意)之前一天当天的第一次尿液。每 天监测所有的败血症患者，并且当确诊AKI时，通过排空尿收集袋来收集 新鲜尿液。冷冻所有的样品，并且在分析Hsp72水平之前将其保存在-80℃。

在健康供体和AKI患者中的Hsp72尿水平。(结果)

为了确定Hsp72是否是检测人中的AKI的敏感生物标志物，通过蛋 白质印迹法分析该蛋白在健康供体中的尿水平，并且与在重症监护病房中 已发展AKI的那些患者进行比较。AKI的定义为：血清肌酸酐增加至少 0.3mg/dL，或6小时的尿体积少于0.5ml/kg/h。表1显示了来自5名健康 肾供体和9名患有败血症性AKI的患者的一般特征和肾功能。在AKI患 者的组中，5名为女性，4名为男性，年龄范围在24到84岁。进入ICU 时，所有的患者显示正常的血清肌酸酐值，然而他们在ICU期间，肌酸酐 从0.55+-0.05增加到2.30+-0.52mg/dL，显示了AKI的发展。在图9中 显示了尿的Hsp72水平。在健康肾供体的尿中，Hsp72几乎检测不到(33.7 +-7.1任意单位)，而在AKI患者中Hsp72水平增加(583+-85.1)。注意， 两名诊断患有AKI的患者在住院期间死亡，并且是显示较高Hsp72水平 的患者。

表1.在健康肾供体和患有败血症性急性肾损伤的患者中的一般特征 和肾功能

健康肾的活体供体

败血症性急性肾损伤患者

附图简述

图1.在经历假外科手术和经历了10，20，30，45和60分钟的局部缺血 和24小时的再灌注的大鼠中的肾功能参数。AKI由下述证实：血清肌酸 酐增加(A)，连同肌酸酐清除率的减少(B)和肾血流减少(C)，不伴随平均动 脉压的变化(D)。*p＜0.05对比假外科手术。

图2.来自每组的肾用PAS染色的皮质下组织学切片。(A-F)，每个视 野的管型数目计数；对每只大鼠定量5个视野(G)。通过刷状缘的损失和 极性，以及细胞脱附确定肾小管损伤区域百分比。*p＜0.05对比假外科手 术。

图3.肾小管损伤和氧化应激标志物量化。与假外科手术的组相比， 在具有I/R的组中，NAG(A)、蛋白(B)和H₂O₂(C)的尿排泄升高。*p＜0.05 对比假外科手术。

图4.(A)在经历I/R的大鼠的皮质中Hsp72 mRNA水平。(B)对肾 皮质中的Hsp72蛋白水平的蛋白质印迹分析并且其在经历不同时期I/R的 大鼠中过量表达。(C)尿Hsp72浓度。*p＜0.05对比假外科手术。

图5.(A)在尿Hsp72的量和管型形成之间的正相关。(B)在尿Hsp72 的量和肾小管受影响区域的％之间的相关性，r＝0.79和p＜0.0001。

图6.(A)在经历了双侧局部缺血的大鼠中，蛋白质印迹分析产生了 尿hsp72浓度。(B)在通过蛋白质印迹法检测的Hsp72的量与管型形成之间 的相关性。

图7.(A)琼脂糖凝胶电泳显示了尿提取的RNA的完整性。(B)在经历 了I/R的大鼠的尿中的Hsp72 mRNA水平。*p＜0.01对比假外科手术。(C) 在尿Hsp72 mRNA水平和管型形成之间的相关性。

图8.在经历了30分钟的双侧局部缺血和不同时期的再灌注：3，6，9， 12，18，24，48，72，96，120小时的大鼠中的尿NAG、蛋白和Hsp72定量。 *p＜0.05对比假外科手术.

图9.通过蛋白质印迹分析确定的在健康肾供体和AKI患者中的尿 Hsp72水平。