环境因子对红豆杉生长及紫杉烷类化合物含量和产量的影响

摘要

根据以往大量研究的结果，本文首先从不同的方面综述了影响红豆杉生长和紫杉烷类化合物含量的主要因子，并总结了紫杉烷类化合物代谢调控的原理与方法。调查了华南地区红豆杉中紫杉烷类化合物的含量，研究了光照强度、土壤水份含量、重金属、稀土金属元素和营养缺失对栽培的红豆杉小树生长和紫杉烷类化合物含量的影响。 本研究检测了华南地区不同地方野生的和栽培的南方红豆杉(Taxus wallichiana var.mairei)以及栽培的曼地亚红豆杉(Taxus×media)小树枝叶中紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ的含量。首次发现栽培于广东中西部地区的南方红豆杉小树枝叶中紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ含量较高，分别可达0.0264±0.0031％和0.0533±0.0012％，改变了传统研究多认为南方红豆杉枝叶中紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ的含量较低，没有商业价值的结论。由于南方红豆杉是红豆杉属生长最快的变种，大田栽培的四年生小树的鲜重平均可达2.4吨/亩。相对于树皮，枝叶比较容易收割，代表着一种可以再生和持续利用的资源，经过优良种质的选育，具有潜力成为紫杉醇及其化学半合成前体供应的一个主要品种，商业开发前景广阔。在南方栽种的曼地亚红豆杉的紫杉烷类化合物含量比在北方的低，且生长速度慢，不适合在南方推广。 定量研究光照强度和土壤水分含量对栽培曼地亚红豆杉小树的紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ产量影响的结果表明在光照强度实验中40±5％(1813.4±226.7MJm-2year-1)的透光率，土壤水分含量实验中20.10±0.62％的土壤水分含量最有利于紫杉醇和10—脱酰基巴卡丁Ⅲ的累积，两种条件的协同处理可以进一步显著地提高目的化合物的产量。 把重金属离子银和铜以不同的剂量作为肥料添加剂施加后，测试结果显示Cu<'2+>在红豆杉的大田栽培上有较好的应用前景。对每棵曼地亚红豆杉施用50.0rag CuSO<,4>·5H<,2>O的实验组，10-脱酰基巴卡丁Ⅲ的含量与产量分别比对照组提高了37.9±0.3％和35.6±2.5％，紫杉醇的含量与产量也略有提高。用10<'-3> M Cu<'2+>浓度的Hogland培养基水培的南方红豆杉实验组比对照组10-脱酰基巴卡丁Ⅲ的含量提高了42.4±0.7％。根据实验结果推断Cu<'2+>对紫杉烷类化合物合成的促进作用位点应在10-脱酰基巴卡丁Ⅲ之前，是通过促进10-脱酰基巴卡丁Ⅲ的合成而提高紫杉醇含量的。在高浓度下，Cu<'2+>会抑制植株生长和根的伸长并导致老叶枯死，新叶缺绿。与广泛报道的组培和细胞培养结果不同，大田栽培时AgNO<,3>在不同的剂量下不同程度地抑制了紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ的生物合成及红豆杉的生长。为进一步提高紫杉烷类化合物的产量，CU<'2+>的最佳施用量、作用机制及同其它诱导因子的协同作用亟待进一步深入研究。 将稀土元素钇和镧的化合物作为肥料的添加剂对水培和土壤栽培的曼地亚红豆杉小树施用一段时间后，采集枝叶样品检测的结果显示它们在两种栽培方法中显著地提高了紫杉醇的含量但会同时降低水培红豆杉中10—脱酰基巴卡丁Ⅲ的含量。镧对两种紫杉烷类化合物的含量和产量的作用效果明显比钇好，有广泛应用于红豆杉大田栽培的良好前景。与对照组相比，在合适的浓度下，镧可分别提高水培和土壤栽培的曼地亚红豆杉紫杉醇产量的236.5％和98.3％，对土壤栽培的两个实验组中的每棵小树每三个月分别用200ml 10<'-2>和10<'-3>M La(NO<,3>)<,3>溶液处理可以分别提高10-脱酰基巴卡丁Ⅲ产量的32.1％和50％。不同于镧，额外施加钇会因剂量的不同而不同程度地抑制小树的生长，对土壤栽培的红豆杉紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ的产量基本上没有促进作用。基于实验结果和以往的研究，进一步提出了稀土元素更象是通过影响细胞的生理功能和膜通透性而不是仅仅通过Ca<'2+>起作用的。 本项目还研究了N，P,K,Ca,和Mg的缺失对用Hogland培养液水培的南方红豆杉小树生物量、紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ含量的影响及出现的可见症状，并记录了缺铁的可见症状及其生物量的相应变化。不论缺少的是哪种营养，每个处理的实验组都在生物量和紫杉烷类化合物产量上呈现出不同程度的下降，并出现了各种各样的可见症状。相对于对照，氮和磷的缺失培养并没有导致紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁-Ⅲ含量的显著不同。缺氮的植株出现了轻微的萎黄病，缺磷的植株颜色深绿，但没有明显可见的症状。缺磷的处理植株紫杉醇的含量显著低于对照组。缺钾的植株叶子枯黄且尖端坏死，茎细而弱，老叶被感染且半坏死紫杉醇含量明显低于对照组，可是10-脱酰基巴卡丁-Ⅲ的含量几乎高出了对照一倍。缺钙的植株，幼枝和根的尖端经常坏死，幼叶开始时卷曲，而后尖端和边缘坏死，叶通常黄色，生物量极低，只相当于对照组的1／3，紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁-Ⅲ的含量都远低于对照组。缺镁的植株生物量略降低，但见不到明显不同的症状。缺铁的植株幼叶叶脉枯黄，茎矮短而细弱，生物量是所有营养缺失处理的组中最低的，只有对照的1／4。基于这些试验结果和已往的研究，提出了一些影响渗透性、离子平衡和膜通透性的因素往往在紫杉烷类的生物合成中影响很大，其作用机理需要进一步研究。这些结果可以广泛地应用于产业化栽培中营养缺失的诊断和紫杉烷类化合物的产量评估。 本研究还探讨了SFE的最优化萃取条件，首先考察温度、压力、流量，以及萃取时间对产率的影响，建立一组正交实验。然后以正交实验的最优条件加不同夹带剂进一步实验的结果显示，以甲醇作夹带剂，在萃取压力为28MPa，萃取温度为50℃，CO<,2>流量为5 L／h，一级、二级分离压力均为5 MPa，分离温度均为30℃时的效果最好，以乙醇做夹带剂次之，丙酮最差，不加夹带剂的效果更差。

目录

文摘

英文文摘

第1章前言

1.1红豆杉和紫杉醇

1.1.1红豆杉简介

1.1.2紫杉醇的发现与应用

1.1.3国内红豆杉的栽培现状

1.1.4目前紫杉醇生产的市场预测及发展趋势

1.2影响红豆杉生长和紫杉烷类化合物含量的因子

1.2.1品种及栽培变种

1.2.2气候、海拔和地形

1.2.3土壤

1.2.4人为因素和食草动物的摄食

1.2.5季节变化和采集时间

1.2.6年龄与性别

1.2.7组织部位和生长形状

1.2.8储藏条件

1.2.9激素和代谢旁路抑制剂

1.3需要继续研究的几个方面

1.3.1最适合各栽培地的优良品种的筛选和新品系的培育

1.3.2定点与大尺度实验相结合研究宏观生态因子对生长和含量的影响和机理，调节小环境促进红豆杉紫杉烷类化合物和生物量的积累

1.3.3肥料添加剂对红豆杉生长和紫杉烷类化合物含量的影响及作用机理

1.3.4激素和代谢旁路抑制剂对含量的影响和机理

1.3.5与其他植物的关系以及怎样利用混种促进红豆杉的生长，使经济效益最大化

1.3.6调查宏观生态因子、土壤成分、激素和代谢旁路抑制剂的配伍使含量最大并应用于生产实践，建立栽培的GAP规范

1.4紫杉醇的生物合成途径及代谢调控

1.4.1紫杉醇的生物合成途径

1.4.2诱导子和旁路抑制剂

1.5对生态因子调控和诱导子的研究的综合意义

第2章实验方法及紫杉醇超临界萃取条件的探索

2.1红豆杉的栽培方法

2.1.1水培

2.1.2盆栽和大田载培

2.2样品中紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ含量的萃取和检测

2.2.1试剂与仪器设备

2.2.2溶液冷浸萃取

2.2.3预处理

2.2.4高效液相色谱（HPLC）分析

2.2.5回收率测定

2.3紫杉醇超临界萃取条件的探索

2.3.1超临界CO2萃取技术

2.3.2实验及其结果

第3章华南地区红豆杉中紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ含量的调查

3.1南方红豆杉的小树枝叶中发现高含量的紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ

3.1.1植物材料和结果

3.1.2结果的分析和讨论

3.2华南地区红豆杉中紫杉烷类化合物含量的资源化学调查

3.2.1实验样品的采集

3.2.2结果

3.2.3结果分析

3.2.4讨论

第4章光强和土壤水分含量对红豆杉紫杉烷类化合物产量的影响

4.1实验

4.2结果

4.2.1光强的影响

4.2.2土壤水分含量的影响

4.2.3光和水的协同作用

4.3讨论

4.3.1光影响的双重性

4.3.2土壤湿度对红豆杉生长影响的双重性

4.3.3光照强度和土壤水分含量的协同作用

第5章Ag+和Cu2+对栽培曼地亚红豆杉和南方红豆杉小树紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ含理和产量的影响

5.1植物材料和处理

5.2结果和结论

5.2.1对大田栽培的Taxus×media小树的影响

5.2.2Cu2+对水培Taxus wallichiana var.mairei小苗的影响

5.3讨论

第6章稀土元素对栽培曼地亚红豆杉小树紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ含量和产量的影响

6.1实验

6.2实验结果

6.2.1对紫杉醇和10脱酰基巴卡丁Ⅲ含量的影响

6.2.2对各实验组平均每株小树生物量鲜重的影响

6.2.3对各实验组紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ的总产量的影响

6.3讨论

6.3.1La的作用

6.3.2Y的影响

6.3.3La作用机理的推测

6.3.4进一步的研究

第7章营养缺失对南方红豆杉小树紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ含量、产量和表观性状的影响

7.1实验

7.2结果

7.2.1表观症状

7.2.2对紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ含量和产量的影响

7.3讨论

第8章结论与展望

8.1结论

8.2展望

8.2.1种质的选育

8.2.2筛选高效组合并做出可增加紫杉烷类化合物产量的产品

8.2.3根据次生代谢水平的变化研究作用机理

8.2.4调节宏观生态因子促进红豆杉生长和紫杉烷类化合物积累

8.2.5通过对酶等生理、生化指标的检测研究各种因子的作用机理

8.2.6紫杉烷类化合物含量与品种及年龄的关系

8.2.7结合同位素示踪方法研究紫杉烷类化合物相互转化的机理

参考文献

附录 攻读博士学位期间发表的和已投出的学术论文

致谢

原创性声明