利用抗AcMNPV P74多克隆抗体对P74跨膜区宿主特究异性的研究

摘要

本文制作了抗AcMNPVP74的多克隆抗体，以检测替换后的重组蛋白ASP74在病毒粒子上定位的情况。首先通过PCR扩增出AcMNPVp74ORF全长片段，将它插入到表达载体pET28a中，将构建好的重组子转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达产物以包涵体形式存在，表达量并不高。为了获得高表达量的重组蛋白以进行免疫，又构建了含有P74N末端亲水区序列的重组质粒pET21b-p74(2-194)，表达产物仍是以包涵体形式存在，表达量很高，达到总体蛋白的35％。通过去垢剂和低浓度尿素处理后，获得较纯的包涵体粗提物。用包涵体粗提物与弗氏佐剂混合乳液免疫雄性纯种新西兰兔。采用皮下多点注射免疫六次后，从颈动脉采血。分离出抗血清，并进行纯化。利用制备的血清可以检测到野生型病毒P74蛋白的表达，这表明用包涵体直接免疫的方案是可行的。吴无畏利用RT-PCR证明了重组后病毒部分替换的p74进行了转录，但是却丧失了口服感染能力，表明P74C末端跨膜区也是影响宿主范围的因子之一。本文在蛋白水平进一步研究口服能力丧失的原因，利用抗血清无法检测到病毒粒子上有替换后的重组蛋白ASP74的存在，推测是由于SpltMNPVP74的跨膜区无法将蛋白定位至对于AcMNPV敏感的Sf9细胞核内环状区。跨膜蛋白如果无法正确定位在膜上，就会被分子伴侣识别，从而导致替换后的蛋白ASP74被降解。　　本实验所做工作的意义在于：首先，初步证实了包涵体蛋白作为免疫原的可行性，这一操作避免了蛋白质复性复杂的工艺流程。其次，为用免疫学手段来进一步研究AcMNPVp74基因的口服感染功能及分子机制提供了必需的辅助材料——抗P74的血清。最后，尝试利用抗血清在蛋白水平上解释P74蛋白C末端的宿主专一性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

前言

杆状病毒简介

杆状病毒口服感染影响因子研究进展

本论文实验设计路线

第1章关于杆状病毒p74基因的生物信息学简介

1.1.P74基因序列特征

1.2.利用P74基因编码的氨基酸序列构建分子进化树

1.2.1.距离矩阵法构建进化树

1.2.2最大简约法分析

第2章AcMNPVp74基因的原核表达

2.1.材料和方法

21.1.材料

2.1.2.方法

2.2.结果与分析

2.2.1.p74全长基因重组表达质粒的构建

2.2.2.pET28a-p74(1-645)在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

2.2.3.含有P74 N末端序列的重组表达质粒的构建

2.2.4 pET21b-p74(2-194)在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

2.3.讨论一

2.3.讨论二

2.3.讨论三

第3章兔抗P74 N末端重组蛋白的多克隆抗体的制备

3.1.材料和方法

3.1.1.材料

3.1.2方法

3.2.结果与分析

3.2.1.重组蛋白的初步纯化

3.2.2多克隆抗体效价的检测

3.2.3.Western blot检测抗体的特异性

3.3.讨论

第4章用抗血清检测部分替换p74基因重组病毒中AS P74蛋白的定位情况

4.1.材料和方法

4.1.1.材料

4.1.2.方法

4.2.结果与分析

4.3.讨论

小结与展望

参考文献

致谢

原创性声明