杆状病毒AcMNPV体内、体外复制时基因组的变化

摘要

本研究以杆状病毒模式种苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)的细菌人工染色体(AcBAC)为研究对象。AcBAC既能感染宿主，也可以象质粒一样在E.coli中复制，因此可简单、快速获得基因型均一的子代病毒。但AcBAC的多角体基因已被插入失活，为了使其具有口服感染性，本研究通过位点特异性重组，构建了能够产生多角体的重组病毒AcBACph作为本研究的实验材料。AcBACph在体外(Hi-5细胞和Sf-9细胞)、体内(四龄粉纹夜蛾幼虫)中进行连续传代时产生了多种子代病毒突变株。利用BAC-AcMNPV-E.coli研究平台和RFLP技术对体内、体外的第1，5，10代子代病毒进行REN分析：AcBACph在Hi-5细胞中和四龄粉纹夜蛾幼虫中连续传代后，所产生的子代病毒共有的基因组区域、基因组的平均大小、完整基因型所占比例都很相似；它们的第l代子代病毒包含较多病毒突变株，基因组序列完整的病毒株仅占6％(Hi-5)和2％(Tn幼虫)，第5代的完整病毒株占52％(Hi-5)和87％(Tn幼虫)，第10代的完整病毒株占82％(Hi-5)和83％(Tn幼虫)。AcBACph在Sf-9细胞中连续传代后，病毒基因组的变化模式却有所不同，第一代、第五代、第十代完整病毒株所占比例分别是：3％、2％、3％。无论在体外还是体内传代时，PstI-Dl、PstI-D2、PstI-N均存在于子代病毒基因组中。某些突变株具有超摩尔带，例如：PstI-D2、PstI-I,、PstI-J，并且这些超摩尔带均具有复制原点。应用TCID50技术检测了病毒感染细胞所产生的芽生型病毒的毒力，活体生测技术检测了病毒感染Tn幼虫产生的多角体的毒力，发现病毒群体中完整病毒的比例与病毒的毒力不呈正相关。

目录

论文说明：资助、缩略词

第一章前言

第二章可产生多角体的重组病毒AcBACph的构建

2.1材料与方法

2.2结果

2.2.1通过位点特异性重组构建重组病毒AcBACph

2.2.2通过电击转化和抗性筛选从DH10 β中甩掉Helper plasmid

2.2.3利用QiaGen Large Construct Kit制备超纯AcBACph

2.2.4利用生物信息学软件——Vector NTI 9.0分析AcMNPV的物理图谱及AcMNPV所有ORF、hrs和non-hr在AcBACph上的分布

2.3小结

第三章AcBACph在昆虫细胞中无稀释连续传代的研究

3.1材料与方法

3.2结果

3.2.1 REN分析AcBACph在Hi-5细胞无稀释连续传代过程中产生的子代病毒

3.2.2 AcBACph在Hi-5细胞无稀释连续传代时，每一代的多角体产量和被感染细胞的病理变化

3.2.3 AcBACph在Hi-5细胞无稀释连续传代时，每一代BV毒力的变化

3.2.4 REN分析AcBACph在Sf-9细胞无稀释连续传代过程中产生的子代病毒

3.2.3 AcBACph在Sf-9细胞无稀释连续传代时，每一代的多角体产量和被感染细胞的病理变化

3.2.4 AcBACph在Sf-9细胞无稀释连续传代时，每一代BV的毒力变化

3.3小结

第四章AcBACph在四龄粉纹夜蛾中连续传代的研究

4.1材料与方法

4.2结果

4.2.1通过虫体注射，获得以包涵体形式存在的AcBACph(AcBACph-TnL-1P-P)

4.2.2 REN分析AcBACph在四龄粉纹夜蛾传代时产生的子代病毒

4.2.3 AcBACph在四龄粉纹夜蛾幼虫中连续传代时所产生的多角体的半致死剂量(LD50)的变化

4.2.4小结

第五章讨论

5.1完整基因组型的AcMNPV在体内、体外进行首轮复制后产生的缺损型子代病毒在整个病毒群体中占优势

5.2 AcMNPV在Hi-5、Sf-9细胞系中无稀释连续传代时产生不同的基因组变化模式

5.3 AcMNPV在粉纹夜蛾宿主的体内、体外进行传代时，其基因组的变化模式具有相似性

5.4缺失突变是AcMNPV基因组在体内、体外复制时主要的突变方式

5.5某些子代病毒的PstI-D2、PstI-I、PstI-J变成超摩尔带，这可能使这些子代病毒具有复制优势

5.6 AcMNPV在体内、体外传代时，基因组区域：PstI-D1、PstI-D2、PstI-N始终保持高度稳定，这些区域可能含有对病毒的复制和传播必须的因子

5.7缺损型病毒可能与正常病毒存在协同或拮抗作用

5.8假说

总结

第六章文献综述杆状病毒传代效应研究概述

参考文献

附录-图片

附录-表格1

附录-表格2

致谢

原创性声明