Thidiazuron调控苜蓿愈伤组织分化的分子机制研究

摘要

植物离体发育研究在生物学理论研究和农业生产实践中具有极其重要的意义。迄今为止，在该领域的研究主要集中在对离体发育调控的生理生化机制方面，而对其分子生物学机制的研究则尚不深入，对离体发育早期事件的分子生物学研究则更加稀少。本论文研究了具有细胞分裂素生物活性的苯基脲类化合物thidiazuron(TDZ)在晋南苜蓿(MedicagosativaL.cv.Jinnan)叶柄外植体愈伤组织诱导及其形态发生早期事件中的调控作用，在此基础上，应用抑制性扣除杂交(SSH)技术克隆了TDZ诱导的苜蓿愈伤组织分化相关的一些差异ESTs。通过对这些ESTs的功能分析，首次在分子水平上研究了TDZ对苜蓿愈伤组织分化的调控机制。研究结果如下： 苜蓿叶柄根据其形态分为近茎段、中段和远茎段三部分，其中以自顶端起小叶完全展开的第二叶柄的中段在含2,4-D和激动素(KN)的B5h培养基上诱导形成胚性愈伤组织的能力最强。进一步的实验表明，单独以TDZ作为植物生长物质不能维持该部位叶柄外植体的生长及诱导愈伤组织的形成，说明在苜蓿叶柄外植体的愈伤组织诱导及其形态发生过程中，TDZ不能代替生长素(2,4-D)和细胞分裂素(KN)的共同作用。苜蓿叶柄外植体在含KN和2,4-D的B5h培养基上诱导并继代形成浅黄色松软的胚性愈伤组织，当用TDZ替换B5h中的KN时，愈伤组织变绿变硬，出现深绿色颗粒状结构和管状分子的分化，而其体细胞胚发生能力则丧失。 为了揭示TDZ调控上述苜蓿愈伤组织形态发生转变的分子生物学机制，以这两种表型颜色和形态发生定向截然不同的愈伤组织为材料，应用SSH技术构建了TDZ处理2d、10d和28d的苜蓿愈伤组织扣除cDNA文库。依次通过蓝白斑筛选、PCR扩增插入片段和cDNAmacro-array点杂交技术对扣除文库进行差异筛选，结果显示，TDZ处理第2d时能诱导6-磷酸海藻糖磷酸酶、ACC合成酶、脯氨酸脱氢酶等与胁迫反应有关的酶的基因和参与细胞内无用蛋白降解的泛素基因的表达。这些基因的克隆从分子水平上证实了TDZ确实能诱导植物细胞的胁迫反应。TDZ处理第10d时，一些与细胞内小分子化合物代谢和细胞分裂有关的基因被克隆，表明该时期TDZ处理的细胞已经发生细胞代谢和细胞命运的转变。TDZ处理第28d时，几种可能与管状分子分化有关的酶(ACC合成酶、蔗糖合成酶、多聚半乳糖醛酸酶)的基因被克隆。 通过virtualNorthern杂交对6-磷酸海藻糖磷酸酶基因(TPP)、ACC合成酶基因(ACS)和同源域-亮氨酸拉链蛋白基因(MSHB1)的表达模式进行分析发现，在对照胚性愈伤组织中，TPP基因仅仅低水平表达，但在TDZ处理的愈伤组织中，TPP在处理初期(第2d)的表达水平就极高，第10d时，表达量恢复至本底水平，第28d时，表达水平又升至极高。TPP基因的这一表达模式可能与胁迫反应有关。在培养初期(第2d)，由于接种损伤及培养条件的骤然变化和/或TDZ自身的胁迫作用导致TDZ诱导TPP基因的大量表达，以适应胁迫环境；随着培养时间的延长(第10d时)，愈伤组织损伤修复，并适应了培养环境，而原先积累的海藻糖反馈抑制TPP基因的表达，导致该时期TPP表达水平降低；在培养后期，由于培养基营养成分的耗尽及细胞和培养环境中有害代谢产物(如乙烯)的积累等新的胁迫环境的产生，TDZ再次诱导TPP基因的高水平表达。ACS和MSHB1的表达模式相似。在对照愈伤组织中，ACS和MSHB1基因仅在继代培养初期(第2d)有低水平表达，在第10d和28d表达量未检测到。在TDZ处理的愈伤组织中，ACS在处理初期高水平表达，第10d时略有降低，第28d时又恢复高水平表达。MSHB1在TDZ处理的整个过程中均高水平表达。由此推测这两个基因在TDZ作用初期可能与胁迫反应有关；在TDZ作用约4周时，其基因表达产物乙烯和MSHB1蛋白的积累可能导致愈伤组织表面局部细胞大量增殖和/或管状分子的分化，而不利于细胞的体细胞胚发生感受态的维持。 应用RACE技术获得了MSHB1cDNA全长序列，并对其推导的蛋白质氨基酸序列进行了生物信息学分析，推测该蛋白属于Ⅱ型同源域-亮氨酸拉链蛋白，可能位于细胞核内行使转录因子的功能。其生物活性可能受糖基化、磷酸化等修饰调控，而豆蔻酰化修饰能促进该蛋白与其它蛋白质或膜脂质的相互作用。通过Northern杂交发现，MSHB1在苜蓿幼嫩的根、茎、叶片和叶柄中仅低水平表达，而在TDZ处理的愈伤组织中高水平表达。MSHB1在苜蓿愈伤组织形态发生定向转变中的具体作用仍有待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

第一章文献综述

第二章TDZ对苜蓿愈伤组织形态发生的调控

第三章应用抑制性扣除杂交技术克隆苜蓿愈伤组织中TDZ诱导的差异表达基因

第四章MSHB1 cDNA全长克隆及其组织特异性表达分析

论文总结

参考文献

附：攻读博士学位期间发表及待发表的学术论文

致谢

原创性声明