基因转移CTLA4-Ig和抗CD40L抗体共同诱导异种胰岛移植免疫耐受

摘要

免疫排斥反应目前仍是胰岛移植面临的主要问题。免疫抑制剂的应用，虽然能提高移植物的存活率，但是免疫抑制剂存在致感染、致癌变、致糖尿病的毒副作用，并对胰岛β细胞具有破坏作用。诱导免疫耐受是解决排斥反应问题的理想方法，也是目前胰岛移植研究的热点。 目的:探讨基因转移CTLA4-Ig和抗CD40L抗体共同诱导异种胰岛移植免疫耐受的可能性及其机理，为临床胰岛移植诱导免疫耐受提供新的思路和方法。 方法:(1)采用AdEasy同源重组腺病毒载体系统，构建携带融合基因CTLA4-Ig的重组腺病毒，测定滴度；并用其转染人正常胰岛细胞，RT-PCR检测外源基因CTLA4-Ig的表达。 (2)利用自制的胰岛分离装置消化人胰腺，COBE-2991不连续密度梯度法纯化胰岛细胞。 (3)经尾静脉注入链脲霉素(60mg/kg体重)，复制糖尿病大鼠模型，随机分为A、B、C、D四组。A组植入Ad-CTLA4-Ig转染人胰岛细胞；B组植入人正常胰岛细胞，腹腔注射抗CD40L单克隆抗体；C组植入Ad-CTLA4-Ig转染胰岛细胞，腹腔注射抗CD40L单克隆抗体；D组植入人正常胰岛细胞，作为对照组。监测移植后糖尿病大鼠血糖、生存时间以及移植物存活时间；观测移植物病理形态学改变，采用免疫组化方法检测移植物CTLA4-Ig和Insulin的表达；ELISA方法检测移植大鼠细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平变化。 结果:(1)成功构建了携带基因CTLA4-Ig的重组腺病毒，滴度为3.5×109efu/ml，并能有效感染人正常胰岛细胞，使人胰岛细胞表达重组蛋白CTLA4-Ig。 (2)分离纯化后平均每条胰腺可获取数量为(10.2±2.62)万IEQ的胰岛细胞；胰岛细胞活率为(90±8.6)％，纯度为(56.8±11.3)％；胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好，高糖(300mg/dl)时胰岛素的释放量是低糖(60mg/dl)时的2倍(p＜0.05)。 (3)糖尿病大鼠接受胰岛移植后2天血糖开始下降，于移植后4天下降至正常。 (4)胰岛移植物存活时间，移植对照组、抗CD40L抗体治疗组、Ad-CTLA4-Ig转染组和Ad-CTLA4-Ig和抗CD40L抗体联合治疗组分别为10±2.1、22±8.2、28±6.5和39±9.3天。 (5)糖尿病胰岛移植大鼠生存时间，Ad-CTLA4-Ig和抗CD40L抗体联合治疗组为65±12.5天，Ad-CTLA4-Ig转染组、抗CD40L抗体治疗组和移植对照组分别为48±8.5、35±6.5、21±5.7天；联合治疗组显著长于Ad-CTLA4-Ig转染组(P＜0.05)、抗CD40L抗体治疗组(P＜0.05)和移植对照组(P＜0.01)；Ad-CTLA4-Ig转染组显著较抗CD40L抗体治疗组和对照组延长(P＜0.05)；抗CD40L抗体治疗组又较对照组延长(P＜0.05)。 (6)胰岛移植对照组在移植后3天、7天，细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平均急剧上升，较移植前显著升高(P＜0.01)；Ad-CTLA4-Ig转染组和CD40L治疗组分别在移植后22天和28天时开始上升；而Ad-CTLA4-Ig和CD40L联合治疗组在移植后各时间段均未见明显变化。 (7)移植后15天，3个治疗组移植物HE染色见成片的胰岛细胞团，周围未见淋巴细胞浸润，免疫组化染色见胰岛细胞棕黄色的Insulin蛋白表达，AdCTLA4-Ig转染组可见胰岛细胞棕黄色的CTLA4-Ig蛋白表达。 (8)移植后30天，移植物病理检查，Ad-CTLA4-Ig和抗CD40L抗体联合治疗组可见大片的胰岛细胞团，未见明显淋巴细胞浸润；免疫组化染色可见胰岛细胞CTLA4-Ig和Insulin蛋白表达。 结论:(1)采用AdEasy同源重组腺病毒载体系统，可快速、简便获取高滴度的重组腺病毒Ad-CTLA4-Ig。 (2)利用自制的胰岛分离装置和COBE-2991不连续密度梯度法，可分离纯化得到纯度高、活性好、功能较佳的胰岛细胞。 (3)使用基因转移CTLA4-Ig阻断B7/CD28通路和抗CD40L抗体阻断CD40/CD40L共刺激通路，均可延长移植物和糖尿病胰岛移植大鼠的生存时间。其作用可能是通过阻断共刺激通路，抑制T细胞的活化，抑制免疫应答效应过程，诱导Th1/Th2细胞的分化偏移来实现的。 (4)应用基因转移CTLA4-Ig和抗CD40L抗体联合阻断两条共刺激通路，可延长异种胰岛移植糖尿病大鼠和移植物存活时间，并获得较稳定的免疫耐受。

目录

英文缩略词表

前 言

第一部分携带基因CTLA4-Ig重组腺病毒载体的构建和表达

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分人胰岛细胞的分离和纯化

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

基因转移CTLA4-Ig和抗CD40L抗体共同诱导异种胰岛移植免疫耐受

材料和方法

结果

1.RT-PCR检测转染胰岛细胞CTLA4-Ig的表达

2.糖尿病大鼠胰岛移植效果观察

3.糖尿病大鼠胰岛移植后细胞因子变化

4.胰岛移植物病理学检查和免疫组化染色

讨论

结论

参考文献

全文总结

个人简历

博士工作总结

致 谢