肝癌微波消融辅以瘤内注射未成熟树突状细胞诱导特异性抗肝癌免疫应答

摘要

原发性肝细胞肝癌(HCC)占我国恶性肿瘤死亡率第二位，热消融治疗采用微创的方式，促使HCC瘤灶局部温度迅速升高直接杀灭肿瘤细胞，该方法对机体侵袭性小、操作简便且可反复使用，因而近年来已被广泛用于治疗严重肝硬化而不能手术切除或复发的HCC。 治疗恶性肿瘤的要义在于根除肿瘤组织的同时，消除肿瘤潜在的复发。把各种治疗手段有机结合在一起，是治疗的核心内容。利用热消融杀灭肉眼所及的肿瘤灶，充分利用热消融所暴露的TAAs，瘤内注射DC以增加捕获和呈递TAAs的量，从而启动针对特定肿瘤的免疫应答，消除肉眼未及的瘤灶或肿瘤细胞，这理论上将是恶性肿瘤防治的最佳境界。 所以，我们基于上述理论，即寻找最佳的消融温度，既可杀死癌细胞，又可促使肿瘤的免疫原性增加，暴露TAAs；辅以消融瘤内注射iDCs以有效捕获和呈递TAAs，设想该措施可促使机体产生和放大抗肿瘤特异性免疫。 第一部分：C57BL/6j小鼠接种Hepa1-6细胞建立皮下肝癌模型 方法取液氮保存之Hepa1-6细胞株，37℃水浴复温，于DMEM中培养，放入含5％的CO2的培养箱中，经传代3～4次后接种。 结果Hepa1-6细胞附壁生长，呈多形性，培养24～36小时，即可进行1∶3的细胞传代。A组、B组以及C组的成瘤率分别为10％(1/10)、20％(2/10)和90％(9/10)，最早扪及米粒大小的肿瘤结节的时间分别为19d、10d和7d。生长速率和肿瘤倍增时间见表格1，C组肿瘤生长曲线见表格2。 4w龄小鼠接种肝癌细胞后，荷瘤状态下生存时间为49d～73d，中位生存时间为57.5d，平均生存时间为61.4±12.2d；非荷瘤小鼠生存时间为74d～103d，中位生存时间为85d，平均生存时间为85.6±15.1d，经T检验，两组小鼠的生存时间具有统计学差异(t=3.45，P＜0.05)。 皮下肿瘤质软，血运丰富，HE染色见肿瘤细胞排列不规则，大小不一，多见病理性核分裂。 小结以C57BL/6j为实验鼠，按2×106/小鼠的细胞量，皮下接种Hepa1-6细胞，能成功建立适合进行微波消融相关的免疫学层面研究的皮下肝癌模型。 第二部分：C57BL/6j小鼠骨髓CD34+造血干细胞来源的iDC体外培养与鉴定 方法iDC培养：无菌取C57BL/6j小鼠胫骨和股骨骨髓，经200Mu的单细胞过滤钢筛过滤，4％的Tris-NH4Cl溶液裂解红细胞，细胞团重悬于含10％的胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液中，于六孔培养板内培养4h后，换用加有5ng/ml的rmGM-CSF和5ng/ml的rmIL-4的RPMI-1640完全培养液，6～7d后收集悬浮细胞。培养过程中，观察培养DC的形态，培养7d收集细胞后，采用流式细胞仪鉴定悬浮生长的细胞的CD80、CD86和CD11c等表面分子的表达情况。 结果骨髓细胞去除红细胞培养4h后，10％细胞贴壁生长。加含rmGM-CSF和rmIL-4的培养液培养贴壁细胞2d后，逐渐呈集落样悬浮生长，体积变大，有树枝状突起。第6d时，细胞集落呈密集的葡萄串状，细胞体积增大，形态学逐渐不规则，毛刺状或根须状突起更明显，呈现iDC的典型形态。经培养7d计数，每个6孔培养板可收集2×107的细胞数目。 小结联合使用rmGM-CSF和rmIL-4定向诱导培养骨髓CD34+造血干细胞，可大量扩增出iDC。 第三部分：C57BL/6j小鼠皮下肝癌微波消融后瘤内注射iDC的归巢研究肿瘤热消融治疗后能否产生免疫效应方法小鼠皮下肿瘤直径达到8mm～10mm，沿肿瘤长轴插入电极针，接通电源和通过功率输出调节消融条件，使插在肿瘤中央以及旁开0.2cm和0.3cm处的测温针显示温度分别达到90±5℃，65±5℃和50±5℃并维持3min。 结果消融后3天内小鼠死亡率为12.5％(2/16)，无发生与iDC注射相关的死亡。消融14天后，50±5℃消融的周缘组织未见残留的存活癌组织，且周缘肿瘤细胞保留组织学结构，其间散在噬酸性颗粒物质和淋巴细胞浸润。 共聚焦荧光显微镜下，PKH26-DC细胞轮廓清楚，染料分布均匀，iDC突起大而精细，荧光标记率98％。台酚蓝染色显示细胞存活率在95％以上。 脾脏内未能检出PKH26-DC。在未消融组和50±5℃消融组，瘤内注射的PKH26-DC可在引流淋巴结内检出，但50±5℃消融组明显比未消融组多(32±8/21±6，t0.05(18)=2.552，p=0.04)。归巢DC呈圆形或椭圆形，表面突起细小致密。在65±5℃和90±5℃消融组，未能在淋巴结内检出PKH26-DC。 未消融组瘤内注射PKH26-DC后24h归巢DC的CCR7表达率为90％左右，显示为黄色荧光；50±5℃消融组归巢DC的CCR7表达率为100％；65±5℃和90±5℃消融组未检出CCR7表达。 引流淋巴结单细胞悬液内归巢DC和淋巴细胞形成的免疫突触簇以及簇内淋巴细胞数目，在未消融组较少(4～6簇/100倍视野，3～10/簇)，而50±5℃消融组明显增加(8～12簇/100倍视野，12～25/簇)。 小结肝癌热消融能够促进iDC的成熟和归巢，刺激淋巴细胞的免疫反应，但消融的温度必须适当。 第四部分：C57BL/6j小鼠皮下肝癌消融后瘤内注射iDC诱导体内特异性抗肝癌免疫 方法建立肝癌模型，对合适大小肿瘤予以微波消融，操作同前一节所述，通过功率输出调节消融条件，使插在肿瘤旁开0.3cm处的温度分别达到45±2℃、50±2℃、55±2℃和60±2℃并维持3min。另外，设立假消融组：插入消融针3min后拔除。消融后72h，分别对不同温度消融的肿瘤注射2×106(0.1ml)的iDC。消融或假消融14天(iDC注射11d)，经眼动脉取血送流式细胞学检查，计算外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的变化。 无菌取脾，过滤成单细胞悬液，Tris-NH4Cl裂解红细胞，于含20％FBS和rmIL-2的DMEM培养液中培养5d后，调节细胞浓度为105/m1。将培养5d后的脾淋巴细胞与丝裂霉素灭活的Hepa1-6细胞或B16淋巴瘤细胞(丝裂霉素：肿瘤培养液=50μg：1ml)以10∶1的比例混合，作为检测细胞。(一)酶联免疫斑点法检测消融辅以瘤内注射iDC前后脾脏淋巴细胞分泌白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)及干扰素-γ(IFN-γ)的情况。(二)乳酸脱氢酶(LDH)释放方法检测消融辅以瘤内注射iDC前后脾脏淋巴细胞的杀伤活性。 结果1.50℃或55℃消融瘤内注射iDC后，其外周血CD4+T细胞水平明显升高，与单纯同样温度消融相比，P＜0.05；与单纯瘤内注射iDC或45℃以及60℃消融相比，P＜0.05。50℃消融瘤内注射iDC后，其外周血CD8+T细胞水平明显升高，和单纯同样温度消融相比，P＜0.05；和单纯瘤内注射iDC相比，P＜0.05。45℃消融、50℃消融或55℃消融瘤内注射iDC后，和单纯同样温度消融相比，其外周血NK细胞水平明显升高，P＜0.05；50℃或55℃消融瘤内注射iDC后，与单纯瘤内注射iDC相比，P＜0.05。 2.50℃或55℃消融瘤内注射iDC后，与单纯同样温度消融相比，其脾淋巴细胞分泌IFN-γ细胞数目明显增加，P＜0.05；50℃或55℃消融瘤内注射iDC后，与单纯瘤内注射iDC、或45℃及60℃消融瘤内注射iDC相比，其脾淋巴细胞分泌IFN-γ数目明显增加，P＜0.05。55℃消融瘤内注射iDC后，与单纯同样温度消融者相比较，其脾淋巴细胞分泌IL-4细胞数目明显减少，P＜0.05；55℃消融瘤内注射iDC后，和单纯瘤内注射iDC相比，其脾淋巴细胞分泌IL-4数目明显减少，P＜0.05。 3.50℃或55℃消融瘤内注射iDC后，其脾淋巴细胞对Hepa1-6的杀伤率明显升高，与单纯同样温度消融相比，P＜0.05；与单纯瘤内注射iDC者相比，P＜0.05。单纯瘤内注射iDC以及45℃、50℃或55℃消融瘤内注射iDC后，与B16相比较，其脾淋巴细胞对Hepa1-6的杀伤率明显升高，P＜0.05。50℃消融后辅以瘤内注射iDC者，与单纯同样温度消融者相比，其脾淋巴细胞对靶细胞B的杀伤率明显升高，P＜0.05。 小结50℃～55℃热消融肝癌后瘤内注射iDC，可诱导产生杀伤特异性肿瘤细胞的CTL。 结论1.以C57BL/6j为实验鼠，皮下接种Hepa1-6细胞，能成功建立适合进行微波消融相关的免疫学层面研究的皮下肝癌模型。 2.联合使用rmGM-CSF和rmIL-4定向诱导培养小鼠骨髓CD34+造血干细胞，可大量扩增出iDC。 3.皮下肝癌热消融能够促进瘤内注射的iDC成熟和归巢，刺激淋巴细胞的免疫应答，但消融的温度必须适当。 4.50℃～55℃热消融肝癌后瘤内注射iDC，可诱导产生杀伤特异性肿瘤细胞的CTL。 5.适当温度热消融后瘤内应用iDC可望成为一条HCC免疫治疗的有效途径。

目录

致谢

前言

第一部分C57BL/6j小鼠接种Hepa1-6细胞诱导皮下肝癌模型的建立

第二部分：C57BL/6j小鼠骨髓CD34+造血干细胞来源的iDC的体外培养与鉴定

第三部分：C57BL/6j小鼠皮下肝癌微波消融后瘤内注射iDC的归巢研究

第四部分C57BL/6j小鼠皮下肝癌消融后瘤内注射iDC诱导体内特异性抗肝癌免疫

结论

展望

参考文献

附图表

本研究所使用的主要仪器和设备

综述 热消融治疗肝细胞性肝癌的抗肿瘤免疫效应问题

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