人Micro-dystrophin基因修饰MDX鼠骨髓间充质干细胞治疗DMD的实验研究

摘要

Duchenne型肌营养不良症(DuchenneMuscularDystrophy,DMD)是一种以骨骼肌进行性变性、坏死为主要病理特征的致死性的X-性连锁隐性遗传性肌肉疾病，病因是编码骨骼肌膜上抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的基因突变或缺失致使肌膜上缺乏此蛋白，肌膜不稳定，不能耐受运动损伤而导致肌肉萎缩无力。 目前DMD仍无有效的治疗办法，研究主要集中在药物治疗、基因治疗和细胞治疗。药物治疗采用药物作用于DMD病理生理的特定环节，延缓疾病的发展，改善症状但无法阻止病情的进展。基因治疗是向靶细胞引入正常有功能的基因以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷，从而达到治疗疾病的目的。DMD细胞治疗包括成肌细胞和干细胞移植治疗。干细胞携带人体正常的基因组，具有成肌分化潜能，引起了研究者们探索肌肉和非肌肉来源成体干细胞移植治疗DMD的兴趣。其中骨髓间充质干细胞(MSC)因为容易获取，体外培养简单，长期培养仍然保持多向分化潜能和生物学特性不变，可以静脉移植，分布范围广，成为理想的组织工程种子细胞。但是异体干细胞移植引起免疫排斥反应，需要放疗或化疗进行免疫抑制，如果能应用自体干细胞，体外基因修正后回输体内进行DMD治疗将绕过免疫排斥问题，提高疗效。因此结合基因与干细胞治疗两种方法，自体干细胞基因修饰治疗已成为DMD治疗的新途径。 本研究拟将DMD细胞治疗和基因治疗结合起来，构建micro-dystrophin基因真核表达质粒，采用脂质体介导micro-dystrophin基因转染mMSCs，移植治疗mdx鼠，探讨干细胞携带外源基因在移植鼠体内分化为有功能的肌细胞的可能性和机制，为自体干细胞体外基因修饰后移植治疗DMD的临床应用提供理论依据。 1材料和方法 1.1实验材料 1.1.1实验动物4-6周龄mdx鼠用于分离mMSCs，进行体外实验和细胞移植。6-8周龄mdx鼠24只，随机分为两组,12只作为阴性对照，12只移植microdys-mMSCs。分别于移植后4周、8周、12周、16周取材。每组各时间点动物为3只。 1.1.2实验试剂与器材(略) 1.2实验方法 1.2.1真核表达质粒pcDNA3.1(+)/microdystrophin的构建及鉴定将质粒PBSK-MICRO、pcDNA3.1(+)转化感受态细菌进行扩增，提取质粒DNA分别进行NotI酶切。切胶回收microdystrophin目的基因，应用CIP使线性pcDNA3.1(+)载体5'末端去磷酸化，然后用T4连接酶将目的基因和载体连接，构建pcDNA3.1(+)/microdystrophin，并进行酶切和测序鉴定。 1.2.2mMSCs分离、培养、鉴定应用含10％胎牛血清和10ng/mlbFGF的L-DMEM培养mMSCs，差速贴壁法分离、扩增及纯化mMSCs，并进行表面抗原测定和两性霉素B诱导成肌。 1.2.3microdystrophin基因转染mMSCs及鉴定采用Lipofectamine2000介导质粒pcDNA3.1(+)/microdystrophin转染mMSCs，G418筛选阳性细胞。应用免疫荧光、western-blot鉴定microdys-mMSCs中有microdys蛋白的表达，应用RT-PCR鉴定有microdysmRNA的转录。 1.2.4mMSCs基因转染、筛选和mdx鼠尾静脉移植在6孔板基因转染mMSCs(方法同上)，筛选并扩增microdys-mMSCs，通过尾静脉移植入mdx鼠，移植细胞数量为2×106/只。 1.2.5移植后运动功能测试在移植后各时间点测试移植组和未移植组mdx鼠牵引实验。让鼠4爪抓住钢丝，计数3min内从钢丝上坠落次数。 1.2.6移植后肌酸激酶(CK)的测定移植后不同时间点分别取移植组和对照组mdx鼠1.2ml外周血，取血清约250ul,CK-NAC检测CK值。 1.2.7移植后骨骼肌组织HE染色不同时间点分别取移植组及未移植组鼠腓肠肌和膈肌，冰冻切片后进行HE染色，镜下观察细胞形态，200×取5个视野，计数肌细胞核中心移位纤维比例。 1.2.8移植后骨骼肌Microdys的免疫荧光、RT-PCR、WesternBlot检测不同时间点分别取移植组及未移植组鼠腓肠肌和膈肌，做免疫荧光染色、RT-PCR和WesternBlot，检测microdys的表达情况，计数microdys阳性肌纤维比例。 1.2.9移植后腓肠肌MyoD免疫荧光、RT-PCR、WesternBlot检测不同时间点分别取移植组及未移植组鼠腓肠肌进行免疫荧光染色、RT-PCR和WesternBlot，检测MyoD的表达情况。 1.2.10移植后腓肠肌devMHC的免疫荧光、RT-PCR、WesternBlot检测不同时间点分别取移植组及未移植组鼠腓肠肌进行免疫荧光染色、RT-PCR和WesternBlot，检测devMHC的表达情况。 1.2.11Microdys-mMSC移植后在mdx鼠体内生物安全性观察不同时间点解剖移植鼠，观察各器官形态结构有无异常，有无肿瘤或者畸形的发生。 1.2.12统计分析所有统计学数据采用SPSS12.0进行单因素方差分析，有意义水平为P＜0.05。 2结果 2.1重组质粒pcDNA3.1(+)/microdystrophin的鉴定结果酶切和测序证明真核表达质粒pcDNA3.1(+)/microdystrophin构建成功。 2.2mMSCs的生物学特性及成肌诱导分化差速贴壁法可以高效分离、扩增及纯化mMSCs。原代及P1代细胞呈克隆样生长，P2代以后细胞克隆形成不明显，呈均匀分布生长，一般3～4天即可生长至融合。 2.3重组质粒转染mMSCs并表达microdys蛋白采用脂质体Lipofectamine2000将质粒pcDNA3.1(+)/microdystrophin、pcDNA3.1(+)/EGFP转染入mMSCs，48h后大约有5％～10％的细胞内可见绿色荧光；加入200ug/mlG418筛选10天，绿色荧光阳性细胞约90％～95％，停用筛选培养基，约8～10天细胞生长达到融合。将筛选的microdys-mMSCs通过尾静脉移植入mdx鼠。免疫荧光、RT-PCR、Western-blot结果可以看到microdys-mMSCs中有microdys的表达。说明转染成功，microdystrophin基因可以在mMSCs中表达蛋白。 2.4移植后运动功能评价移植后各时间点对移植鼠和对照鼠进行牵引实验，结果发现移植后各时间点mdx鼠3分钟内从钢丝上坠落的次数与未移植组没有统计学差异。 2.5移植后CK值的变化移植后各组mdx鼠CK值较未治疗组mdx鼠明显下降，移植后各组与未移植组间差别均有统计学意义，P＜0.05。 2.6移植后腓肠肌、膈肌的病理变化mdx鼠腓肠肌和膈肌中，均有大量的炎性细胞浸润，肌细胞大小不一、有萎缩和肥大细胞，肌细胞失去正常的多角形形态，变成圆形，大量纤维结缔组织浸润，肌细胞核中心移位现象明显。细胞移植治疗以后肌组织内炎性细胞浸润减轻，细胞大小趋于统一，核中心移位现象减少。 2.7移植后腓肠肌、膈肌Microdys表达的动态变化应用鼠抗人dystrophin氨基端(321-494氨基酸)特异性单克隆抗体进行免疫荧光染色，显示microdys-mMSCs移植治疗的mdx鼠，4周腓肠肌microdys阳性纤维数约0.9％，荧光较弱，在膈肌大约为0.6％；随移植时间延长表达渐渐增多，8周和12周时腓肠肌阳性细胞数分别占细胞总数的3％和6％，16周时进一步增多，约为8％；膈肌略少，大约为6％。RT-PCR、WesternBlot检测microdys的表达，结果移植后4周mdx鼠可见微弱表达，随着移植时间延长microdys的表达增加，腓肠肌和膈肌的表达趋势基本相同。 2.8移植后腓肠肌MyoD表达的动态变化免疫荧光检测移植后4周mdx腓肠肌MyoD阳性细胞核较mdx鼠稍微增加(8％vs5％)。 2.9移植后腓肠肌devMHC表达的动态变化免疫荧光检测可见移植后4周mdx鼠devMHC阳性细胞较未治疗组稍增多，随移植时间延长devMHC阳性细胞表达增多，细胞体积增大，16周时最多。RT-PCR和WesternBlot均检测到devMHC的表达在移植后随着时间延长逐渐增多。 2.10移植Microdys-mMSC的生物安全性评价各时间点剖析鼠心、肝、脾、肾、肺、胃、小肠、脑、肌肉各器官，观察其形态结构均无异常，未发现有肿瘤或者畸形发生。 3结论 3.1基因缺陷的mdx鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs)体外可以诱导分化为肌样细胞。 3.2脂质体介导质粒pcDNA3.1(+)/microdystrophin转染mMSCs，体外可以检测到胞浆内有microdys的表达。 3.3microdys-mMSCs尾静脉移植治疗mdx鼠，可以修复部分骨骼肌细胞膜，并且随移植时间延长修复作用更明显，说明mMSCs可以携带microdystrophin基因，在体内分化为功能正常的肌细胞。 3.4microdys-mMSCs移植治疗mdx鼠安全有效，说明自体MSCs体外基因修饰后治疗DMD安全可行。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

附录

博士在读期间发表的论文

致谢

原创性声明