Nud C基因的克隆、表达及其蛋白在鼻咽癌细胞系中的作用

摘要

细胞核迁移(nuclearmigration)是一种细胞核向细胞中特定位点移动的非随机现象，对于生长分裂以及发育等正常的细胞活动都是至关重要的，并且普遍存在于从酵母到哺乳动物的许多真核生物中。核迁移蛋白C(nucleardistributionC，NudC)在核迁移中起着重要作用。NudC与其家族成员(包括胞质动力蛋白，肌动蛋白，LIS1和NudE)相互作用，和微管一起参与细胞增殖、神经迁移和脑发育。 微管在多种细胞功能中起着关键作用，以微管动力蛋白为靶点，在有丝分裂过程中阻抑微管功能的抗肿瘤药物，例如紫杉醇、秋水仙素、长春花碱等在治疗肿瘤方面已经显示出它的重要性，已被广泛应用并取得了较好的疗效。但是受药物自身性质的影响，临床使用中逐渐暴露出来一些亟待解决的问题。例如，肿瘤细胞的耐药性、较差的水溶性和毒副作用等。 在人类，己证明NUDC的表达是被高度调控的，它的表达水平与各种细胞类型、增殖状态有关，不同分裂能力的细胞呈现出不同水平的NUDC表达。正在分裂的细胞中可以观察到NUDC强烈的免疫标记，NudC的mRNA水平在细胞周期的G1中期增加，NudC的蛋白水平在细胞周期的G2/M期增加了2倍，在生长速率高的哺乳动物细胞中NudC的表达水平也是升高的。这些研究显示NUDC的水平与癌细胞的增殖过程有密切的关系。因此这使NUDC很可能成为检测肿瘤发生的一项指标。 头颈部恶性肿瘤中，鼻咽癌在广东地区的发病率为30-50/10万人口，俗称“广东癌”。目前鼻咽癌治疗方法以放疗、化疗和手术为主，但对晚期、复发及远处转移的患者疗效不理想。鼻咽癌是一种增殖失控的疾病，而细胞增殖是通过细胞周期实现的，其中有丝分裂和胞质分裂是细胞周期中的重要阶段。由于NUDC是完成有丝分裂所必需的蛋白，因此我们设想寻找特异性的小分子抑制剂来阻滞NUDC表达，使分裂增殖旺盛的鼻咽癌细胞停滞在有丝分裂期，从而NUDC很可能具有抑制肿瘤的活性，并成为肿瘤治疗的新靶标。 因此，本论文首先使用大肠杆菌原核表达系统对NudC基因进行克隆、表达和纯化。使用PCR方法，以质粒pB42AD-NudC为模板，扩增人NudC全长cDNA，限制性酶内切酶BamHI、XhoI及T4连接酶将NudC基因克隆于pET-28b构建重组表达载体，筛选阳性克隆后，经酶切和测序鉴定后，在大肠杆菌中BL21(DE3)中进行原核表达重组NUDC蛋白，并利用蛋白N'端的6个氨基酸尾确立了一套稳定、有效的重组蛋白NUDC的纯化工艺。利用金属亲和层析和DEAE阴离子交换层析，对表达后以水溶性形式存在的重组蛋白NUDC进行纯化。结果显示：经阳性筛选及测序分析，NudC基因全长cDNA成功克隆到质粒pET-28b，pET-28b-NudC可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达NUDC融合蛋白，并通过亲和层析及过柱获得高纯度的NUDC蛋白。 将纯化的NUDC蛋白多次多点免疫新西兰白兔，制备抗NUDC蛋白多克隆抗体，通过琼脂双向扩散实验初步检测其免疫原性，通过ELISA确定多克隆抗体免疫效价，SDS-PAGE检测其纯度，WesternBlot鉴定抗体蛋白特性。试验结果表明成功制备和纯化了抗NUDC蛋白多克隆抗体，多克隆抗体免疫效价达到1∶25600，SDS-PAGE检测其纯度达到90％。 本论文首次使用间接免疫荧光染色法检测了NUDC在鼻咽癌细胞系CNE-2、HNE-2中的亚细胞定位。以抗NUDC蛋白多克隆抗体作为一抗，以经过FITC免疫荧光标记的羊抗兔IgG抗体作为二抗，并使用DAPI荧光染料特异地标记细胞核，将NUDC蛋白标记为绿色荧光，细胞核标记为蓝色荧光。结果发现NUDC蛋白在鼻咽癌细胞中表达主要位于细胞质核区附近，细胞核也可见少量表达。而NUDC蛋白在作为对照的人成纤维细胞NIH-3T3中的表达量相对较少。 同时，以鼻咽癌细胞细胞系CNE-2、HNE-2作为研究对象，鼻咽非癌性组织作为对照，裂解分离细胞和组织蛋白后，通过SDS-PAGE蛋白电泳和WesternBlot方法，在蛋白水平检测了NUDC蛋白在鼻咽癌细胞CNE-2、HNE-2和鼻咽非癌性组织中的表达情况。结果证明在鼻咽癌细胞CNE-2、HNE-2均有NUDC蛋白表达，且其在鼻咽癌细胞中的表达量明显高于鼻咽非癌性组织。 为了进一步探索鼻咽癌新的治疗方法，本论文还使用MTT方法初步探讨了NUDC抗体对鼻咽癌细胞活性的影响。通过向培养的鼻咽癌细胞CNE-2、HNE-2中加入不同浓度的NUDC抗体溶液共培养一定时间后，观察鼻咽癌细胞CNE-2、HNE-2的细胞活性。结果证明鼻咽癌细胞的生长活性随着培养液中抗NUDC蛋白的抗体浓度增加呈现下降趋势，且存在着剂量-反应关系。 综上所述，本论文成功地克隆、表达和纯化了NUDC蛋白，并成功制备其多克隆抗体，证明了NUDC蛋白在鼻咽癌细胞中的表达和分布情况，创新性地证明了NUDC蛋白在鼻咽癌的发生发展中起着重要的作用，并且抗NUDC蛋白抗体可在体外明显地抑制鼻咽癌细胞CNE-2、HNE-2的生长。这为进一步研究NudC在肿瘤发生、发展过程中的分子作用机制提供了一定的理论依据，也为开发治疗鼻咽癌的新型制剂打下了良好的工作基础，这很有可能为鼻咽癌治疗提供新的思路。

目录

摘要

细胞核迁移基因Nud C前言

第1章Nud C基因的克隆、表达及纯化

第2章抗NUDC蛋白抗体制备

第3章鼻咽癌细胞系中核迁移蛋白的表达及作用

总结

参考文献

攻读博士期间发表论文情况

致谢

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