人工寒潮促发脑卒中发病及其机制的实验研究

摘要

第一部分人工寒潮时大鼠脑卒中发病的影响因素 背景和目的 自然寒潮由于受季节限制且每次寒潮的主要指标很难一致，影响了结果的分析，为此我们改装了RXZ-300A型智能人工气候箱，按广东省气象局制定的寒潮标准(日平均气温在24小时内急剧降温≥8℃或48小时内降温≥10℃，而且过程中最低气温≤5℃)来实施人工寒潮，一次寒潮(22℃×24h-3℃×12h-22℃×24h)肾血管性高血压大鼠(renovascularhypertensiverats，RHR)的脑卒中发病率达16％，获得较理想的结果。 然而，温度变化对高血压病相关疾病死亡的影响有明显的滞后性和持续性，低温的影响达到顶点的时间各个报道(24～54小时、6小时～5天、6～7天)不等。以往我们仅研究一天寒潮的影响未能真正反映临床的实际情况，因此在本课题中我们在使用改造的人工气候箱模拟自然寒潮的同时，延长寒潮时间，考虑到人们冬天留在温暖室内的时间也相当长，常处于室内外变动中，因此本研究还采用寒冷与室温交替的方法，以期更真实地反映日常生活中寒潮对人们的影响。 本研究的目的在于寻找尽可能真实模仿自然寒潮对于脑卒中发病影响的人工寒潮处理方法，以进一步利用此模型探讨寒潮促发脑卒中发病的机制。根据预实验的结果，还将RHR分成不同血压水平，探讨人工寒潮时不同血压水平对脑卒中发病的影响，以了解不同水平的患病基础上发病诱因所起的作用。 方法 应用双肾双夹法复制RHR模型，术后12周形成稳定高血压后，正常血压组与RHR组各分为寒潮和非寒潮两大组。寒潮组置于人工气候箱中，温度设置以22℃12小时，4℃12小时为1天循环，共3天。非寒潮组置于温度22℃的人工气候箱共3天。正常血压大鼠寒潮和非寒潮组各30只，160mmHg～199mmHgRHR、200mmHg～219mmHgRHR、≥220mmHgRHR各50只。在人工气候箱处理前后测量体重、血压，以寒潮3天、出现偏瘫症状或意识障碍、死亡为研究终点，在研究终点将大鼠断头取脑，先肉眼观察出血情况，再用三苯唑氯化物(triphenyltetrazoliumchloride，TTC)染色观察梗死情况，然后取连续石蜡切片，HE染色确定脑卒中情况。 结果 除160～199mmHg组外，正常大鼠与其余血压亚组的RHR经寒潮后体重均减轻，血压越高者经寒潮后体重减轻越明显。正常鼠经人工气候箱处理(寒潮或非寒潮)后血压均升高，160～199mmHgRHR经人工气候箱非寒潮处理后血压也有所升高，RHR经寒潮后血压均较寒潮前降低，血压较高(200～219mmHg、≥220mmHg)者即使未经寒潮血压也较寒潮前降低。 寒潮组RHR的脑卒中发生率为29.3％，非寒潮组RHR的脑卒中发生率为17.3％，两者有显著性差异(P＜0.05)。病灶分布在皮质或皮质下白质的病灶占91.7％，以枕顶区多见，额叶未见病灶。 脑出血发生率明显高于脑梗死、混合性中风的发生率(P＜0.001)。血压≥220mmHgRHR的寒潮组、非寒潮组之间的脑卒中发生率有显著性差异(P＜0.05)，其余各血压亚组的寒潮组、非寒潮组之间的脑卒中发生率无显著性差异。 无论寒潮或非寒潮组，血压＜220mmHg与血压≥220mmHgRHR的脑卒中发生率有显著性差异(P＜0.001)。 将人工气候箱处理前后体重、血压以及是否经人工气候箱处理等5个自变量以ENTER法进入Logistic回归，发现只有寒潮前血压是脑卒中发生的唯一独立危险因素(脑卒中发生=0.072×寒潮前血压-12.725，P＜0.01)。 结论 1.寒潮虽非脑卒中的独立危险因素，但在严重的脑血管病变(高血压)的基础上，也是一个重要的外部诱发因素。 2.本研究采用的人工寒潮方法能更好地模拟自然寒潮时临床脑卒中的发病情况，对于进一步研究气象因素促发脑卒中的机制以及预防有重要意义。由于高血压越高及经历寒潮而尚未发生脑卒中的大鼠越接近卒中前状态，加上人工寒潮易于控制、量化的特点，本研究采用的模型是适合卒中前状态研究的理想模型之一。 第二部分人工寒潮促发脑卒中发病的机制研究 背景和目的 本研究第一部分肯定了两个事实：1)脑血管病变必须达到一定的严重程度才具备易卒中的条件；2)在严重的脑血管病变基础上，在外部因素(寒潮)的作用下，更易于促发脑卒中。当满足其中一点而又尚未发生脑卒中时，机体所处的状态均可被称为卒中前状态，其对于脑卒中预防是相当重要的阶段。研究卒中前状态，第二点应该更具代表性。第一点的相关研究已较多而全面，但关于第二点的研究比较缺乏，且存在一些问题。鉴于凝血、纤溶分子及细胞粘附分子与脑卒中及其危险因素的密切关系，根据以往研究存在的问题及第一部分的研究结果，第二部分将重点研究：1)不同血压水平对血浆凝血酶激活的纤溶抑制物(thrombin-activatablefibrinolysisinhibitor，TAFI)、蛋白C(proteinC，PC)、vWF、凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombincomplexes，TAT)、纤溶酶-α2-抗纤溶酶(plasmin/α2-anti-plasmin，PAP)以及脑血管内皮vWF、VCAM-1、ICAM-1、P-选择素的影响；2)不同血压水平下寒潮对以上指标的影响。由于血压越高，加上寒潮的影响，卒中发生率越高，因此高血压越高及经历寒潮而尚未发生脑卒中的大鼠就越接近卒中前状态，是本研究的重点，了解该状态下内皮功能的变化是国内外的首次研究，对明确卒中前状态的机制及进一步指导脑卒中预防有重要意义。另外，本研究还比较脑卒中与非卒中大鼠的上述指标的不同，以了解脑卒中前、后内皮功能的改变。 方法 实验动物分组方法同第一部分，各亚组12只大鼠。发生脑卒中者被剔出卒中前状态的分析，另外补充处理大鼠，保证原位杂交及免疫组化每亚组各有6只无卒中大鼠。 静脉取血抗凝，4℃离心，收集血浆，-80℃保存，ELISA或发色底物法检测血浆vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平。已取血的大鼠，灌注后断头取脑，由嘴侧至尾侧每2毫米切成一冠状薄片，嘴侧2毫米脑片置于冻存管中，-80℃保存，备做实时荧光定量RT-PCR。取视交叉层面作以下处理：1)每亚组6只视交叉层面连续石蜡切片，每8张取1张切片作免疫组化检测血管内皮的vWF、ICAM-1、VCAM-1、P-选择素的蛋白表达，其余切片作HE染色，了解是否有卒中病灶；2)每亚组6只视交叉层面冰冻切片机连续切片，每8张取1张切片作原位杂交检测血管内皮的ICAM-1、VCAM-1、P-选择素的mRNA表达，其余切片作HE染色，了解是否有卒中病灶。视交叉层面以外其它脑片连续石蜡切片，HE染色，了解是否有卒中病灶。结果1.剔除脑卒中的各血压亚组大鼠经人工气候箱处理后血浆vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平、脑血管的vWF的mRNA表达(目的片段拷贝数/GAPDH拷贝数，VWF/GAPDH)与蛋白表达、脑血管的VCAM-1、ICAM-1、P-选择素的mRNA表达(比较原位杂交阳性信号及实时荧光定量RT-PCR，目的片段拷贝数/GAPDH拷贝数，VCAM-1/GAPDH、ICAM-1/GAPDH、P-选择素/GAPDH)与蛋白表达变化趋势一致如下： 1.1在＜220mmHg血压组，寒潮组的血浆vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平、脑血管内皮vWF、VCAM-1、ICAM-1、P-选择素的mRNA表达与蛋白表达比非寒潮组均有升高趋势。在≥220mmHg血压亚组，寒潮组的上述指标比非寒潮组均有降低趋势。 1.2在非寒潮组，血浆vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平、脑血管内皮vWF、VCAM-1、ICAM-1、P-选择素的mRNA表达与蛋白表达均随血压升高而升高。在寒潮组，上述指标在血压＜220mmHg时均随血压升高而升高，然而在血压≥220mmHg时转为降低。 2.脑卒中大鼠的血浆vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平及脑血管内皮粘附分子vWF、VCAM-1、ICAM-1、P-选择素的mRNA表达、蛋白表达均与未发生卒中者不同，脑梗死与脑出血之间的上述各种指标的表达也不同。 结论 1.非寒潮时脑血管内皮细胞粘附分子的表达、凝血、纤溶功能随血压升高而增强，与脑卒中发生率随血压升高而增加的变化趋势一致。脑血管内皮损害对脑卒中发作起重要作用。 2.寒潮可加重脑血管内皮损害，寒潮后脑卒中发生率增高。 3.本研究中细胞粘附分子、凝血、纤溶以及血压等各个指标的变化趋势的一致性提示长期持续的高血压损害了RHR血管内皮各个系统的调控功能，血压越高调控功能越差，当有诱因存在时，调控功能衰竭，易卒中状态更加明显。

目录

文摘

英文文摘

引 言

第一部分 人工寒潮时大鼠脑卒中发病的影响因素

第二部分 人工寒潮促发脑卒中的发病的机制研究

结 论

创新与展望

参考文献

附表、附图

英文缩写词表

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