SARS冠状病毒N蛋白和E蛋白特异性细胞免疫记忆及T细胞表位的研究

摘要

严重急性呼吸综合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)是2002年底最先出现在我国广东省的一种新的传染性疾病。该病起病急，传染性强，短短数月时间内全球SARS感染患者确诊病例已超过8000例，死亡病例达774例，是一种严重危害人民生命健康的严重传染病。现已明确一种新的冠状病毒为导致SARS的病原体，并命名为SARS冠状病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus，SARSCoV)。尽管SARS第一次全球爆发已被控制，但对于SARS的认识不深，目前既无特效的药物用于治疗，又未研制出有效的疫苗用于预防，因此很有必要继续深入研究以探索新的防治SARS的方法。 SARS-CoV基因组为单股正链RNA，全长约30kb，至少编码4种主要的结构蛋白：刺突蛋白(Spikeprotein，S)、膜蛋白(Membraneprotein，M)，包膜蛋白(Envelopeprotein，E)和核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein，N)。SARS冠状病毒的结构蛋白诱导的免疫应答具有保护性作用，但有些蛋白可能会诱导有害的免疫反应和/或炎症性的反应，导致病理损伤。成功开发针对SARS的保护性疫苗需要了解不同的免疫系统成分在保护性免疫应答中的作用及鉴定保护性的抗原。表位是与TCR/BCR特异性结合的基本结构单位。大分子抗原一般由多个抗原表位组成，不同的表位诱导的免疫应答不同。因此，鉴定SARS冠状病毒结构蛋白的表位，有助于开发针对SARS的免疫防治措施。 疫苗是遏制传染病的最强有力的手段，而免疫记忆反应的诱导是疫苗成功的基础。目前对SARS-CoV的免疫记忆的研究主要集中在B细胞免疫记忆上，在所有SARS病人体内均可检测到特异性抗体，其特异性IgG可在体内维持至少2年。然而，对人感染SARS-CoV后T细胞的免疫记忆反应知之甚少。病毒感染后免疫保护作用主要由细胞免疫介导，因而探讨SARS-CoV感染后T细胞的免疫记忆反应的产生和维持对于设计有效的疫苗极为重要。 N蛋白为病毒体的内部蛋白，在SARS病毒的四个结构蛋白中最保守，并且在感染过程中的表达也是最丰富的。对其他冠状病毒的研究表明N蛋白可诱导产生具有保护作用的细胞免疫应答。因此N蛋白可能是SARS-CoV疫苗研究中最理想的候选抗原。E蛋白是最小的结构蛋白，只有76个氨基酸，主要散布在病毒上，协同M蛋白参与包膜的形成。由于其在病毒的含量少，一直没有得到深入的研究。但是近来的研究表明E蛋白作为冠状病毒的一种膜蛋白具有重要的生物学功能，E蛋白的免疫学研究也不能被忽视。因此，在本论文研究中，我们选择N和E蛋白作为研究对象，探讨其诱导的免疫记忆反应并鉴定了其T细胞表位。 在本论文的第一部分，我们用ELISA和ELIspot方法证明N抗原特异性T细胞免疫记忆反应存在于所有的SARS恢复期病人体内，并可维持至少2年。用流式细胞术在SARS病人体内证明CD4+和CD8+T细胞均参与SARS-CoVN蛋白特异性免疫记忆反应，但以CD8+T细胞反应为主。CD4+和CD8+记忆T细胞在N抗原的刺激下可迅速产生IFN-γ和IL-2。表型分析表明抗原特异性IFN-γ+CD8+T细胞大部分为TEM表达CD45RA+CCR7-CD62L-，而大部分的IFN-γ+CD4+T细胞为TCM表达CD45RA-CCR7+CD62L-。我们用SARS病人的PBMC对跨越N蛋白全长的57种合成肽进行T细胞表位筛选，结果发现其中N46(aa331～347)、N47(aa339～354)和N48(aa346～362)能被大多数SARS病人的T细胞所识别。因此认为N蛋白的第331～362氨基酸区域是被T细胞识别的优势表位区，至少含有两个T细胞表位(N46和N48)。与以前的文献报道相比较，我们的研究表明SARS-CoV表位特异性的T细胞的频数与其他急性病毒感染后的记忆细胞频数相当。由于SARS-CoV不存在持续感染，并且临床上也从未发现重复感染，因此可以说SARS病人体内N蛋白特异性T细胞免疫记忆的维持是抗原非依赖性的。 在本论文的第二部分，我们用ELISA和ELIspot方法证明E抗原特异性T细胞反应存在于SARS恢复期病人中，并可维持至少2年。用流式细胞术在SARS病人体内证明CD4+和CD8+T均参与SARS-CoV的E蛋白特异性免疫记忆反应，并且在E抗原的刺激下可迅速产生IFN-γ和IL-2。表型分析表明E蛋白特异性IFN-γ+CD8+T细胞大部分为TEM表达CD45RO-CCR7-CD62L-，而更多的特异性IFN-γ+CD4+T细胞为TCM表达CD45RO+CCR7+CD62L-。我们用SARS病人的PBMC对跨越E蛋白全长的9种合成肽进行T细胞表位筛选，结果发现其中E2(aa9～26)、E5(aa33～49)和E6(aa40～57)能被大多数SARS病人的T细胞所识别。因此认为E2(aa9～26)、E5和E6(aa33～57)是E蛋白中被T细胞优先识别的区域，至少含有两个T细胞表位。SARS-CoVE蛋白特异性的记忆T细胞的频数低于N蛋白表位特异性的记忆细胞频数，表明E蛋白的抗原性较弱。 本研究证明N和E蛋白特异性记忆T细胞在SARS恢复期病人体内存在，并可维持至少2年。其次，我们分析了SARS-CoV特异性免疫记忆的表型和功能并鉴定了N和E蛋白的T细胞优势表位。本研究有助于阐明人类感染SARS病毒的免疫应答机制，为发展有效的SARS-CoV疫苗奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：名词缩略表

前言

第一部分：SARS冠状病毒N蛋白的T细胞免疫记忆及表位鉴定的研究

第二部分：SARS冠状病毒E蛋白的T细胞免疫记忆及表位鉴定的研究

参考文献

附录

致谢

原创性声明