骨骼肌卫星细胞培养和定向诱导分化为心肌样细胞的研究

摘要

目的：为了深入探索骨骼肌卫星细胞多向分化的调控机制，为临床上重大肌病细胞移植治疗提供理想的种子细胞。本实验体外培养了SD大鼠骨骼肌卫星细胞，检测了体内骨骼肌成熟发育过程中的相关基因表达，进行了5-氮胞苷诱导肌卫星细胞分化为心肌样细胞的研究。 实验方法与研究内容： 1.用胰蛋白酶对新生鼠骨骼肌组织进行消化，用新改良的percoll密度梯度离心法纯化细胞，在低胎牛血清(2％FBS)条件下培养，观察肌卫星细胞分化为成肌细胞、肌管的过程，并对相应的与肌分化相关的基因表达产物进行了免疫荧光等分析以及细胞形态和生理功能的鉴定等。 2.分别取胚胎大鼠、新生大鼠、成年大鼠骨骼肌组织，然后，再分别提取了肌细胞的总RNA和总蛋白，用RT-PCR方法分析了Myo-D、M-cadherin、GAPDH等基因在不同年龄阶段的表达水平；同时用Westernblot法分析了skeletalmyosin蛋白在不同年龄阶段的表达水平。 3.本研究在前期低血清诱导肌卫星细胞分化的研究基础上，进一步探索了5-氮胞苷(5-azacytidine)诱导肌卫星细胞分化为心肌样细胞的过程。肌卫星细胞在正常血清(15％FBS)条件下培养一周后，用无血清5-氮胞苷诱导24h，然后洗去5-氮胞苷并继续在正常血清条件下培养二周，收集细胞用Westernblot方法分别对心肌特异表达的cardiactroponinT蛋白以及骨骼肌特异表达的skeletalmyosin蛋白进行了鉴定和分析，用成年心肌组织做阳性对照。结果： 1.用新改良的percoll密度梯度离心法分离的骨骼肌卫星细胞的纯度明显高于用常规的差速帖壁法所得细胞的纯度。肌卫星细胞在15％FBS培养条件下可分裂增殖，细胞形态为梭形。换用2％FBS诱导分化的培养条件下，可见骨骼肌卫星细胞逐渐分化为成肌细胞，6天融合成肌管。与此同时，肌卫星细胞分化为肌管的过程中出现了自发收缩现象。免疫荧光分析发现：肌管的desmin、skeletalmyosin抗体鉴定为阳性；进一步用α-银环蛇毒素鉴定不同时期肌细胞表面的乙酰胆碱受体(nicotineacetylcholinereceptor，NAChR)的表达，只见肌管乙酰胆碱受体呈块状聚集，而肌卫星细胞呈阴性反应；用乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)分别刺激肌卫星细胞、肌管，可见乙酰胆碱明显引起肌管的收缩，而不引起肌卫星细胞的收缩。 2.骨骼肌在成熟发育过程中，Myo-D基因表达水平随年龄增加逐渐增强，呈现出从胚胎期的微弱表达，到新生期较强表达，最后到成年期高水平表达的模式(弱—强—最强)。M-cadherin基因表达模式为：在胚胎期表达微弱，新生期表达增强，而到成年期完全无表达(弱—强—无)。skeletalmyosin蛋白表达模式为：在胚胎期表达微弱，新生期和成年期强表达(弱—强—强)。 3.用5-氮胞苷(10μmol/L)诱导肌卫星细胞，可使诱导后的细胞表达cardiactroponinT，不表达skeletalmyosin；作为阳性对照的成年心肌组织也只表达cardiactroponinT，不表达skeletalmyosin。相反，未经5-氮胞苷诱导分化的骨骼肌卫星细胞只表达骨骼肌特异的skeletalmyosin，不表达心肌特异表达的cardiactroponinT。此外，5-氮胞苷诱导分化后的大鼠骨骼肌卫星细胞自发收缩频率比只是低血清诱导的细胞自发收缩频率增加。 小结： 1.采用新改良的percoll密度梯度离心法早期培养的肌卫星细胞纯度明显高于差速贴壁法，较好地满足了下游实验需要。 2.SD新生鼠骨骼肌卫星细胞体外低血清诱导时可自然向骨骼肌方向分化(成肌细胞，肌管)，并表达相应的骨骼肌细胞特异的蛋白。 3.肌管可表达乙酰胆碱受体，乙酰胆碱受体在肌管的膜上呈块状聚集，用乙酰胆碱作用于肌管，可使肌管明显收缩。而骨骼肌卫星细胞乙酰胆碱受体呈阴性表达，对乙酰胆碱作用无收缩反应。 4.在体外，5-氮胞苷(10μmol/L)可诱导(24h)大鼠骨骼肌卫星细胞定向向心肌样细胞分化，诱导后的细胞可表达心肌细胞特异表达的cardiactroponinT蛋白。未经5-氮胞苷诱导的细胞只表达骨骼肌特异的skeletalmyosin。 5.无论大鼠骨骼肌卫星细胞自然分化形成的肌管，还是骨骼肌卫星细胞经5-氮胞苷定向诱导分化形成的肌管均存在自发收缩现象，但后者的收缩频率增加。 结论： 体外培养的骨骼肌卫星细胞具有多向分化潜能。在自然分化条件下向成熟骨骼肌方向分化，而5-氮胞苷则可定向诱导骨骼肌卫星细胞向心肌样细胞方向分化，因此，骨骼肌卫星细胞的分化是可被调控的。

目录

文摘

英文文摘

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.小结

6.结论

参考文献

附录

致谢

原创性声明