热休克蛋白72抑制肾小管上皮细胞凋亡对肾小管间质纤维化的影响

摘要

肾小管间质纤维化是各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同途径。其主要病理变化是肾小管上皮细胞丢失、肾小管萎缩，淋巴细胞和单核细胞浸润、细胞外基质增多及间质中出现大量肌成纤维细胞。越来越多的证据显示，肾小管上皮细胞凋亡对肾小管上皮细胞的丢失导致肾脏萎缩及疾病的进展起着重要作用。但肾小管上皮细胞凋亡对肾间质纤维化的影响尚无直接证据。热休克蛋白72(HSP72)是一种高度保守的内源性、细胞保护性蛋白，在细胞应激时发挥分子伴侣作用。近年来HSP72的抗凋亡作用广泛受到关注。单侧输尿管梗阻模型(UUO)是经典的肾小管间质纤维化动物模型。已有研究证实，UUO模型中HSP72仅在梗阻侧肾表达增高，提示其增高为组织损伤后的一种特异性反应，然而内源性的HSP72不足以起到组织损伤时的细胞保护作用。外源性HSP72是否能在肾小管间质损伤中发挥保护作用，目前国内外未见报道。本研究拟(1)通过施维舒(geranylgeranylacetone，GGA)诱导大鼠特异性高表达HSP72，探讨HSP72对大鼠UUO模型肾小管间质纤维化的影响；(2)通过含HSP72基因的腺病毒感染肾小管上皮细胞株，明确肾小管上皮细胞凋亡与转分化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)的关系并探讨HSP72对转分化的影响，从而为肾小管间质纤维化的防治提供新的思路和理论依据。 第一章HSP72对大鼠UUO模型肾小管间质纤维化的影响 目的：探讨大鼠UUO模型中HSP72对肾小管上皮细胞凋亡及肾小管间质纤维化的影响。 方法：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分成3组：假手术组、模型组和GGA处理组。建立模型前1d开始，GGA处理组和模型组分别给予400mg/kgGGA和溶媒(0.05％阿拉伯树胶+0.008％维生素E)灌胃，每天1次，在模型建立后第3d，7d和14d分别处死大鼠(n=5)。常规染色观察肾脏组织病理改变，间接免疫荧光及western-blot检测细胞紧密连接E-cadherin及肌成纤维细胞标志物α-SMA；免疫组织化学染色检测促凋亡蛋白Bax及增殖细胞核抗原PCNA的表达；TUNEL染色检测肾小管上皮凋亡细胞数；western-blot检测HSP72及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。 结果：UUO模型组第3d、7d和14d肾小管损害的百分比分别为38.6±0.04、65.8±0.07、81.9±0.04，显著高于假手术组(P＜0.05)；肾间质纤维化分值3d、7d和14d分别为0.38±0.15、1.36±0.59、2.87±0.69，显著高于假手术组(P＜0.05)，提示大鼠UUO模型的成功建立。免疫组化染色显示促凋亡蛋白Bax主要位于病变的肾小管上皮细胞胞浆内，与假手术组相比，Bax的表达明显上调，Bcl-2下调，说明大鼠UUO模型中，凋亡信号通路被激活。Western-blot结果显示，GGA组HSP72表达明显上调。GGA干预后7d组肾间质纤维化分值显著降低(P＜0.05)，为0.4±0.25。肾小管上皮TUNEL阳性细胞数(2.81±0.45)及PCNA阳性细胞数减少(17.66±4.51)，与对照组凋亡细胞数(6.78±1.21)及增殖细胞数(113.7±6.36)相比有统计学差异(P＜0.05)。GGA干预后抗凋亡蛋白Bcl-2及上皮细胞连接E-cadherin恢复，肌成纤维细胞标志物α-SMA表达下调。但是，GGA3d及14d组未观察到HSP72改善肾小管上皮凋亡及肾小管间质纤维化的效应。 小结：UUO大鼠模型中肾小管上皮细胞凋亡及肾小管间质纤维化程度随梗阻时间延长而加重。UUO7d时，HSP72可改善肾小管上皮细胞的凋亡及肾小管间质纤维化。 第二章上调表达HSP72抑制肾小管上皮细胞凋亡对EMT的影响 目的：明确肾小管上皮细胞凋亡与EMT的关系，并探讨上调表达HSP72抑制肾小管上皮细胞凋亡对EMT的影响。 方法：NRK-52E细胞分成A：无血清对照组；B：TGF-β1刺激组；C：pan-caspase抑制剂+TGF-β1组；D：腺病毒感染细胞高表达HSP72+TGF-β1组，其中B组分不同浓度组(0.5、1、2.5、5、10、20ng/ml)和不同时间点组(6、12、24、48、72h)。C组pan-caspase抑制剂分不同浓度组(25、50、100、150μM)。荧光显微镜观察腺病毒感染细胞的效率；相差显微镜观察细胞形态学改变，间接免疫荧光及Western-blot检测EMT标志物E-cadherin及α-SMA的变化；TUNEL及AnnexinV-FITC+PI双染观察细胞凋亡的变化，Western-blot检测检测凋亡相关蛋白Bcl-2、pro-caspase3的变化。 结果：TGF-β1呈剂量及时间依赖性同时诱导肾小管上皮细胞EMT及凋亡。经流式细胞仪检测，不同浓度pan-caspase抑制剂组(25，50，100，150μM)凋亡发生率分别为(15.9±1.7)％、(21.1±7.8)％、(16.3±3.7)％、(17.4±4.6)％，与TGF-β1+DMSO组相比(36.6±11.3)％，有显著性差异(P＜0.05)。与TGF-β1刺激组相比，western-blot结果可见不同浓度pan-caspase抑制剂组(50，100，150μM)E-cadherin均有不同程度回升(P＜0.05)；但不同浓度pan-caspase抑制组组间无统计学差异。pan-caspase抑制剂处理后，α-SMA的表达未见明显减弱，提示pan-caspase抑制剂不能改善肾小管上皮细胞EMT。含HSP72RNA的腺病毒感染肾小管上皮细胞后，荧光显微镜下可见GFP荧光阳性率高达90％以上。Western-blot结果腺病毒感染组HSP72显著增高，比对照组高3.41倍。与空载体组、pan-caspase抑制剂组相比，上调表达HSP72的肾小管上皮细胞，其α-SMA的蛋白水平明显降低(P＜0.001)。 小结：Pan-caspase抑制剂预处理不能逆转肾小管上皮细胞EMT。上调表达HSP72可以明显逆转EMT，该效应可能不依赖于其抗肾小管上皮细胞凋亡的作用。 结论1.上调表达HSP72可减轻大鼠单侧输尿管模型中肾小管上皮细胞凋亡以及肾小管间质纤维化。 2.阻断caspase依赖性凋亡途径不能逆转体外肾小管上皮细胞转分化。上调表达HSP72可抑制肾小管上皮细胞转分化。 3.HSP72发挥抗肾小管间质纤维化的效应可能不依赖于其抗肾小管上皮细胞凋亡的作用，具体机制有待进一步探讨。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第一章 HSP72对大鼠UUO模型肾小管间质纤维化的影响

第二章 上调表达HSP72抑制肾小管上皮细胞凋亡对EMT的影响

结论

参考文献

致谢

原创性声明