NOD/SCID鼠荷人视网膜母细胞瘤免疫重建转移模型及转移细胞系建立的实验研究

摘要

立题背景：视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，简称RB)为婴幼儿最常见的眼部恶性肿瘤，其发病率有上升的趋势。它不仅危害视功能而且威胁患儿生命。近年来对于RB的发病机制研究虽有了长足的进步，但临床治疗中仍有不少的问题和困难亟待进一步研究。由于RB多发生于2岁以下的婴幼儿，致使其难于早期诊断发现，以致相当部分患儿就诊时已处于中晚期，使治疗更为棘手。目前，RB的治疗措施主要包括：手术摘除眼球、放疗、冷冻治疗、光动力疗法和化疗等综合治疗。上述各种疗法虽然使RB患儿的预后有了不同程度的改善，但普遍缺乏对肿瘤病变的特异性及针对性。肿瘤的免疫生物学治疗是肿瘤研究领域的热点，已成为肿瘤治疗的第四主要模式。但对于免疫治疗效果的评价以及抗肿瘤免疫机制尚有待更深入的研究。自发性退变是RB的重要特点，其退变率在人类恶性肿瘤中高居首位。目前认为自发性退变与机体的免疫反应密切相关，但具体机制尚不清楚，因此在动物体内重建人的免疫系统，并在此基础上观察肿瘤的发生、发展，以便更好地模拟人类肿瘤的生物学行为，进一步为RB肿瘤的免疫治疗寻找新的突破口。 肿瘤的侵袭转移是恶性肿瘤的基本特征，也是肿瘤治疗困难及失败的原因所在。肿瘤的转移过程相当复杂，其机制尚不完全明确。目前认为肿瘤的转移涉及5个步骤：(1)肿瘤的转化(即指母瘤中瘤细胞的表形和基因的表达改变)；(2)肿瘤的分解(肿瘤的分离和局部的侵袭)；(3)肿瘤内渗于血管、播散；(4)肿瘤细胞的停滞、黏附、及外渗；(5)肿瘤细胞在远处增殖、生长。同样RB的转移是临床治疗的难点及造成患儿死亡的重要原因。RB主要通过以下方式转移：(1)肿瘤从眼到脑可沿视神经直接浸润，通过眼眶软组织的侵范再到眶骨或眶骨各孔进入颅内；(2)视神经内的瘤细胞侵范软脑膜时，通过脑积液循环进入脑和脊髓；(3)血性播散导致广泛转移。(4)在晚期病例当眼前段及前部眼组织大范围侵犯时通过淋巴扩散。迄今为止，对RB转移的研究仅仅局限于对部分病例及其病理结果的分析，还未能揭示RB转移的机制。非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠(NOD/SCID鼠)是严重联合免疫缺陷鼠与NOD-Lt鼠回交所得，其T、B淋巴细胞及先天免疫功能缺乏。由于NOD/SCID鼠较易进行异种移植及人免疫系统重建，目前已被广泛运用于肿瘤的研究。因此，我们推测，如将NOD/SCID鼠应用于RB转移的研究，有可能进一步揭示RB转移的机制，并为临床治疗提供新思路。 研究目的：1.建立人免疫重建NOD/SCID小鼠荷人视网膜母细胞瘤的动物模型，观察其生物学特性。 2.通过建立人视网膜母细胞瘤的NOD/SCID鼠皮下异位移植瘤模型，并探讨转移的发生、分布规律。 3.通过NOD/SCID鼠筛选具有更高侵袭转移的视网膜母细胞瘤细胞系，为深入研究RB的转移及生物学行为提供更好的实验材料。 实验方法：1.将6～8周龄NOD/SCID雌性小鼠随机分为4组：空白组、人化组、单纯荷瘤组及人化荷瘤组，每组各5只。分离健康成年人外周血单个核细胞，分别腹腔注射到人化组、人化荷瘤组。24h后单纯荷瘤组、人化荷瘤组双侧腹股沟处皮下接种人视网膜母细胞瘤SO-Rb50瘤细胞。定期观察小鼠健康状况及移植瘤生长、转移情况。通过形态学、免疫组织化学染色、ELISA法、流式细胞仪等方法检测小鼠人免疫功能重建的情况及移植瘤的生物学特性。 2.NOD/SCID小鼠左侧腹股沟皮下接种人视网膜母细胞瘤SO-Rb50瘤细胞，观察荷瘤小鼠生活行为及移植瘤的形成、生长，定期处死小鼠观察肿瘤转移的发生及分布。通过形态学，免疫组织化学染色方法，对皮下原发肿瘤及远处转移灶行组织病理学研究。 3.通过对RB转移灶瘤组织的细胞培养及连续传代，建立了RB转移细胞系，采用形态学、体外生长曲线、流式细胞仪、致瘤及转移动物实验等研究其生物学特性。 结果：1.荷瘤组及人化荷瘤组RB皮下异位移植瘤潜伏期为12～19天，成瘤率为100％，组织学形态及免疫组化特点与人类的低分化RB一致。移植瘤及转移灶内可见散在或灶性分布的人阳性淋巴细胞。免疫重建后9天人化组及人化荷瘤组小鼠血清可检测到人IgG存在，并随时间的延长逐渐升高。第26天，人化组IgG为10.72±0.46ug/ml,人化荷瘤组16.96±0.47ug/ml,二者在各时间点均有统计学差异。同时在小鼠外周血及脾脏中流式细胞仪检测到人CD4+、CD8+T淋巴细胞。 2.NOD/SCID小鼠肿瘤生长的潜伏期为12～19天，成瘤率为100％，5只小鼠有远处转移灶，发生转移的时间在32天后，时间分布不一，肿瘤转移灶主要分布在腹腔和肾旁，小鼠的异种移植瘤和转移灶组织形态上与人类的RB一致，光镜下细胞胞质少、核深染、可见病理性核分裂，为未分化型。 3.对肾脏旁转移灶瘤细胞进行培养，瘤细胞成团生长，连续传代，建立了RBM-1转移细胞系。目前RBM-1已成功传至115代。RBM-1与SO-Rb50相比体外生长更为迅速，细胞倍增时间分别为23.13h，29.75h。NOD/SCID鼠尾静脉注射RBM-1、SO-Rb50两组比较，RBM-1组较SO-Rb50组有更多的转移灶及转移灶总重量更高，二者均有统计学意义。NOD/SCID鼠皮下分别移植RBM-1、SO-Rb50细胞，发现RBM-1组成瘤潜伏期明显缩短为8～9天，生长更为迅速，转移发生率提高，转移灶位于腹腔及肾脏旁。 结论：1.NOD/SCID鼠能够建立荷人视网膜母细胞瘤皮下异位移植瘤模型，有成瘤率高、潜伏期短的特点，同时可以重建人类的免疫系统，更好的模拟人类RB的生物学特性。 2.将视网膜母细胞瘤SO-Rb50瘤细胞移植到NOD/SCID鼠皮下，出现远处全身转移，转移率随小鼠荷瘤时间延长而升高。 3.将视网膜母细胞瘤SO-Rb50瘤细胞移植到NOD/SCID鼠皮下，出现转移灶，分离肾旁转移灶的瘤细胞进行培养，建立了转移细胞系RBM-1，RBM-1比亲本细胞系SO-Rb50有更高的侵袭转移能力。

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