环境内分泌干扰物的分析方法建立、环境监测和生殖内分泌毒理研究

摘要

环境内分泌干扰物(Endocrinedisruptingchemicals，EDCs)对人类和动物的生殖内分泌干扰效应引起了国内外研究学者的广泛关注。水生环境中痕量EDCs的监测及其对鱼类的生殖内分泌毒理研究是各种研究领域的前沿工作。水生环境和生物体中EDCs和性类固醇激素的存在具相互关联的特性。本论文的研究目的是通过建立环境水和生物样品中痕量多组分(多种EDCs和自然类固醇激素)同时分析的测定方法入手；监测养殖水体中EDCs的污染状况；阐明EDCs干扰鱼类生殖内分泌的可能途径，并结合细胞生物学方法研究EDCs的生殖毒性。主要研究内容如下： 1.采用固相微萃取(Solidphasemicroextraction，SPME)/硅烷化技术与气相色谱质谱联用，建立了同时测定多种EDCs和自然类固醇激素的分析方法。目标化合物选用三种典型EDCs：壬基酚(technicalgradenonylphenol，t-NP)、辛基酚(octylphenol，OP)和乙烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)；及五种自然类固醇激素：脱氢异雄(甾)酮(dehydroisoandrosterone，DEHA)，雌酮(estrone，E1)，雌二醇(17β-estradiol，E2)，睾酮(testosterone，T)和孕烯醇酮(pregnenolone，PREG)。详细优化了影响手动固相微萃取和硅烷化性能的各种参数，包括萃取时间和温度、离子强度、pH值、衍生化时间和温度。所建立的方法对目标化合物的定量线性范围跨越了三个数量级，平均相关系数为0.9968。在河水和血液中目标化合物的最低检出限/(定量限)分别为0.002～0.378/(0.008～1.261)μg/L和0.004～0.474/(0.013～1.579)μg/L。将所建立的方法与传统的固相萃取(Solidphaseextraction，SPE)技术进行了比较。相比于SPE，SPME具较低的检出限、样品消耗体积少、不需要溶剂等优点，是同时分析EDCs和类固醇激素的简单快速和灵敏的方法。将建立的方法应用于实际样品分析，在河水中t-NP、OP和DES的浓度分别为0.15、4.67和0.02μg/L，而在鱼类血液中则达到1.61、1.08和4.58μg/L；类固醇激素E1、E2和T在河水中分别为0.18、0.10和5.55μg/L，在雌鱼血浆中E1、E2和PREG分别为1.61、1.08和4.58μg/L。 2.基于手动方法，建立了全自动多组分同时分析的方法。优化了可能影响方法性能的各种操作条件，包括萃取时间、衍生化时间、离子强度、pH值、预置温度、样品体积和萃取溶剂等。大部分目标化合物的定量线性范围跨越了三个数量级，相关系数为0.9932～1,检出限和定量限分别为0.001～0.124μg/L和0.004～0.413μg/L。与手动方法相比，自动方法缩短了样品分析时间，耗费人力少，分析通量和精密度有所提高。建立的全自动方法也应用于实际样品中目标化合物的检测，其测定结果与手动方法处于同一数量级，无显著差异。因此，建立的全自动SPME/硅烷化/气相色谱质谱联用在环境样品多组分分析中显示有良好的应用，并比手动方法的性能有所改善。 3.采用自动分析方法，初步调查了珠三角冬季养殖水体中上述目标化合物的污染状况。结果发现：(1)几乎在所有样本中都可检出上述三种EDCs和二种自然类固醇雌激素，同一化合物在不同样本中的浓度均处于同一数量级，在不同地段之间无明显区别；(2)三种EDCs的含量分别为：OP浓度介于0.06～0.85μg/L，均值为0.26μg/L；t-NP浓度介于1.75～6.02μg/L，均值为3.40μg/L；DES浓度介于＜定量限～0.009μg/L，均值为0.003μg/L；(3)两种自然雌激素含量分别为：E1浓度介于0.08～0.35μg/L，均值为0.19μg/L；E2浓度介于0.04～0.22μg/L，均值为0.10μg/L。 4.研究了性成熟雄性鲫鱼(Cyprinuscarpio)重复暴露于不同浓度的t-NP(处理浓度分别为1，10和100μg/L)中的生殖内分泌毒理。以DES(处理浓度为10μg/L)为阳性对照，对水和血浆样品中t-NP、DES和性类固醇激素的动态变化进行了同时分析。结果发现：(1)t-NP和DES处理组的原始实际浓度一般约为处理浓度的60-80％(t-NP分别为1.39、8.57和64.45μg/L，DES为6.48ug/L)，并在施加后迅速下降，在鱼血浆中则检测到高浓度的t-NP和DES，表明t-NP和DES已积累在鱼体内，鱼类的吸收是t-NP和DES下降的主要原因；(2)在10μg/L浓度处理下，t-NP在血浆中的生物富集因子(bioconcentrationfactor，BCF)值为20，比DES的BCF值(4.9)高约4倍，说明t-NP在体内代谢比DES慢；(3)t-NP处理引起了显著的剂量和时间相关的雌激素(E1和E2)浓度升高和雄激素(T)水平的降低，10μg/LDES处理引起了比100μg/Lt-NP处理更显著的相似情况的激素水平变化。说明t-NP和DES具相似的作用机制，都是通过雌雄激素比例的改变引起雌激素效应，且DES的雌激素效应远比t-NP强；4)在10μg/LDES处理21天后，雌激素和雄激素浓度均比14天时稍有下降。可能是鱼体积累了一定阈值浓度的EDCs后，产生了不同于雌激素效应的毒性效应。 5.以EDCs处理21天的性成熟雄性鲫鱼为研究对象，通过光学显微和透射电子显微方法，对其精巢和肝脏的组织病理损伤进行了研究。结果表明：(1)t-NP对肝脏和精巢的结构病变具剂量效应，且10μg/LDES处理能引起比100μg/Lt-NP处理更显著的相似的组织病变现象，表明t-NP和DES具同样的作用机制，且DES的雌激素效应远远大于t-NP，这与激素变化的结论一致；(2)100μg/Lt-NP和10μg/LDES处理导致精巢的精小囊结构退化，精子细胞发育异常，与该浓度处理下引起的雄激素水平降低有关。此外，支持细胞数目增多，与退化的生殖细胞有关；间质细胞肥大，与激素生成状态改变有关；(3)100μg/Lt-NP和10μg/LDES处理引起肝细胞滑面内质网增生，溶酶体增多，说明肝脏正处于积极的解毒状态，与该浓度暴露下鱼血浆中已积累高浓度的EDCs有关；(4)100μg/Lt-NP和10μg/LDES处理引起肝细胞粗面内质网增生，表明肝脏正处于活跃的蛋白生成状态，是由于该浓度处理下雌激素水平升高，导致卵黄蛋白原的生成。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要缩略语表

第1章引言

第2章水和生物样中EDCs和性类固醇激素的同时分析-手动固相微萃取硅烷化气相色谱质谱的应用

第3章水和生物样中EDCs和性类固醇激素的同时分析-自动固相微萃取硅烷化气相色谱质谱的应用

第4章珠江三角洲冬季养殖水体中EDCs和类固醇激素的初步分析

第5章EDCs的动态变化及对鲫鱼血浆中性类固醇激素水平的影响研究

第6章EDCs对鱼类损伤的组织病理学分析

第7章结语

附录

致谢

原创性声明