Staphylococcus aureus感染斑马鱼淋巴细胞cDNA文库的构建及其死亡受体基因家族的初步研究

摘要

本文通过对斑马鱼两次腹腔注射金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，成功构建了二次感染斑马鱼的淋巴细胞cDNA的表达文库。对该文库已测得6988条ESTs序列并拼接成5334clusters，获得了大量免疫相关的新基因信息。其间发现斑马鱼的两个死亡受体(ORT和HDR)表达量较高，这暗示了它们在二次感染的免疫应答中可能起着很重要的作用。 死亡受体(DeathReceptor，DR)在免疫细胞凋亡过程中发挥重要作用，它们通过结合特定的配体和依靠胞内死亡结构域(DeathDomain，DD)介导信号从而诱导细胞凋亡。我们PCR分离并克隆得到斑马鱼的五个死亡受体(ORT、DR6、HDR、NGFR和NEW)全长cDNA序列，将它们预测得到的DD与其它物种死亡受体的DD进行比对，比对后计算出的进化树将这一个庞大的基因家族按照功能分成了两大类：一类是跟介导发育相关(DR6和NGFR)；另一类是跟免疫反应信号通路相关(ORT、HDR和NEW)。这为下一步深入研究其功能提供了一定的线索。 通过反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)和胚胎整体原位杂交(WISH)等方法对斑马鱼五个死亡受体进行了表达模式的研究分析，得出它们多数是从胚胎的尾牙期(Budstage)开始表达，HDR和NGFR的表达在胚胎发育到12个体节(12-somite)才开始明显。ORT、NGFR和NEW广泛表达于各个组织，其中在肾、鳃、肠和脑中表达量相对较高，HDR很特异地表达在成鱼肾脏和靠近生殖腺的间质细胞团(intermediatecellmass，ICM)中。而DR6主要表达在肾、脑、眼等地方，原杂图片显示了其在头肾中特异而且有高量的表达，由此推测其功能跟T细胞和B细胞的发育密切相关。 通过分别构建金黄色葡萄球菌和杀鲑气单孢菌(Aeromonassalmonicida)感染斑马鱼的模型，采用实时定量(QuantitativeRealtimePCR)的方法探究了斑马鱼五个死亡受体对在感染状态下免疫应答的变化。在金黄色葡萄球菌感染模型中，除了NGFR没有受影响，其它四个都有相对应的上调：ORT在感染4个小时上调9.4倍，HDR在24小时上调9倍，DR6在4小时上调2.2倍和NEW在24小时上调7.4倍；然而在杀鲑气单孢菌感染模型中，NGFR在感染4小时后上调2.8倍，ORT在15小时上调了4.2倍，HDR同样地在24小时上调了9.8倍，DR6在15小时上调3.5倍，NEW在4小时上调3.1倍。 本文还构建了斑马鱼五个死亡受体的过表达融合载体pCMV-DR-GFP和其相对应的缺失死亡结构域的过表达载体pCMV-DR(D/N)-GFP，通过对老鼠3T3细胞进行转染发现这五个死亡受体的确能在非依赖配体的情况下介导了细胞凋亡的信号。而介导凋亡信号的关键部位是死亡结构域，剔除掉DD的过表达载体丧失了凋亡能力，这个跟哺乳类动物的死亡受体一样。死亡结构域DD的确是在信号传导方面发挥着极其重要的作用。 总之，通过对斑马鱼死亡受体基因功能的初步研究可以加深我们对该家族在斑马鱼体内所起作用的认识和对斑马鱼先天免疫系统和后天免疫系统的了解，而且对建立人类相关疾病模型方面也有很重要的意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

第1章绪论

第2章S.aureus感染斑马鱼淋巴细胞cDNA文库的构建与其EST的初步分析

第3章斑马鱼死亡受体基因cDNA的克隆及比较基因组学的分析

第4章斑马鱼死亡受体表达模式的初步研究

第5章斑马鱼死亡受体在感染状态下实时定量表达的研究

第6章斑马鱼死亡受体过表达的初步研究

总结与展望

参考文献

附录

致谢

原创性声明