烟草航天育种突变体T-cldf及其相关ESTs的研究

摘要

烟草(Nicotiana tabacum)属于茄科(So1anaceae)烟草属(Nicotiana)，是世界性种植的经济作物。中国是烟草大国，既是最大的烟叶生产国，也是最大的烟叶消费国，但并不是烟草强国。中国的烟草育种工作起步较晚，虽然近年来取得了很大的进步，但是烟叶的生产对引进品种具有一定的依赖性。加强中国的烟草育种研究对中国烟草行业的可持续发展具有非常重要的理论和实践意义。 航天育种是航天技术和育种技术相结合的一种新的育种手段，本质上属于诱变育种，因为太空环境中存在微重力、宇宙辐射和高能离子等诱变因素。在我国，结合中国先进的航天技术进行烟草航天育种工作，创新烟草种质资源，促进烟草育种进程。 本研究以搭载中国2002年3月发射的“神州三号”返回式卫星太空飞行(轨道倾角42°，轨道半径343 km)历时162小时的烟草栽培品种K346(Nicotiana　tabacum(L)cv.K346)种子及其留在地面作对照的K346种子(野生型)为材料，研究空间因素对烟草种质的影响，探索烟草航天育种的可行性。 经过太空飞行返回后的烟草种子(SPO)，和其留在地面作对照的K346种子(野生型)种植于中国贵州省烟草研究所的实验场地，烟草播种、育苗、移栽按照烟草栽培的常规管理，在烟草整个生育期，对其生长发育状况及形态特征进行观察和突变体筛选。并采用套袋自交单株留种的方式对获得的拟突变体株系的自交子代(SPl-SP4)进行连续的观察，子一代(SPl)至子四代(SP4)都维持着同样突变性状的突变株系，认为是可遗传的突变体。我们筛选获得了一个命名为T-C1df(Crinkly Leaf and Delay F1owering Mutant of Tobacco)的烟草突变体株系，它具有皱叶及延迟开花的特性。 表型观察表明，烟草突变T-Cldf与其野生型叶片形态之间存在着很明显的差异，突变体T-CIdf自第六真叶开始表现出叶片上表面起皱成波浪状、尤其是次级脉之间叶片上表面生长凸出，而下表面凹陷，但是野生型的叶片表面平整，上下表面几乎没有明显的凹凸。网室中苗期的突变体T-Cldf和移栽到烟草实验场成熟期的突变体T-cldr都能观察到其叶片明显起皱的表型特征。我们用扫描电镜的方法观察并统计叶片表面的细胞发现，在上表面，突变体T-cldf叶片表面单位面积的细胞数比野生型的多约13％，而其叶片表面单个细胞的面积比野生型的小约11％；然而在下表面，它们之间单位面积的细胞数没有差别，细胞平均大小几乎一致。这说明，突变体T-CIdf叶片特异性状是由叶片上下表面生长速率失衡引起的。烟草突变体T-Cldf的另一个明显特征是，生育期比其野生型长，表现为开花时间延迟，从移栽到第一朵花开的时间，烟草突变体T-Cldf比其野生型延迟约19d。 按照烟草行业标准(1996.YC／T39)抗病性的田间调查统计方法，调查突变体T-CIdf及其野生型对烟草青枯病(细菌性病害)、烟草黑胫病(真菌性病害)和烟草普通花叶病(病毒性病害)的抗性，分析结果表明，与其野生型相比，突变体T-CIdf在抗真菌性病害方面有所增强，如抗烟草黑胫病病指平均值从26.2下降到20.8。 应用扩增片段长度多态性技术(AFLP)分析突变体T-CIdf与其野生型遗传多态性的结果表明，用选择性扩增引物E+3／M+3(Ecog I—ACA和Mse I—CTG)扩增，从突变体T-CIdf中检测到3条特异性差异条带，大小分别为250 bp，170bp和140bp：从野生型中检测到2条大小分别为160bp和125bp的差异性条带。这说明烟草突变体产T-CIdf的特异性状的产生是由于空间环境诱导遗传物质的变化引起的。 同时我们以突变体T-CIdf叶片为Tester材料，以其野生型叶片为Driver材料，应用抑制性消减杂交技术(SSH)建立了SSH文库。随机挑选的部分克隆，经过PCR检测和点杂交筛选的阳性克隆进行序列测序，并与GenBank数据库中的序列进行BLAST分析。获得62个ESTs(已登录GenBank数据库)，按照其功能可以分为7类。其中与光合作用相关的ESTs有9个，与结构蛋白相关的有4个，与生理代谢的酶相关的有11个；还有11个基因功能信息未知的ESTs和20个在烟草中首先获得的ESTs。对ZIP蛋白(GenBankAccessNo.EBl02902)，叶片表面蛋白(GenBank Access No.EB102896)，14-3-3蛋白(GenBank Access No．EBl02898)和水孔蛋白(GenBank Access No.EB041772)相关的ESTs在突变体T-cldf及其野生型的叶片中进行半定量RT-PCR分析，结果表明它们在突变体T-cldf叶片中上调表达。 本研究首次报道了通过航天育种获得的烟草突变体株系T-cldf,并从叶片的形态特征、细胞水平、DNA水平对突变体T-cldf行了分析，为烟叶发育的研究提供了良好的研究材料。实验结果表明通过烟草航天育种可以创新烟草种质资源，是烟草育种的一种新途径。

目录

文摘

英文文摘

第1章　文献综述

1.1我国烟草育种进展及发展对策

1.1.1　我国烟草育种进展

1.1.2　我国烟草育种存在的问题

1.1.3　我国烟草育种的发展对策

1.2　航天育种的研究进展

1.2.1　航天育种的起源与发展

1.2.2　空间环境的诱变因素

1.2.3　航天育种的特点与优势

1.2.4　航天育种取得的成就

1.2.5　航天育种的前景及其在烟草育种上的应用

1.3　抑制性扣除杂交技术的发展及其在植物功能基因研究中的应用

1.3.1　抑制性扣除杂交技术的发展

1.3.2　SSH技术在植物功能基因研究中的应用

1.4研究目的和意义

第2章航天育种烟草突变体T－cldf表型特征的研究

2.1　引言

2.2　材料与方法

2.2.1　材料来源

2.2.2　烟草突变体T-cldf叶片表型的观察

2.2.3　烟草突变体T-cldf及其野生型叶片表面细胞扫描电镜的观察

2.2.4　烟草突变体T-cldf开花时间的统计

2.2.5　烟草突变体T-cldf田间抗病性的初步调查

2.3结果与分析

2.3.1　烟草突变体T-cldf叶片表型的特征

2.3.2　烟草突变体T-cldf延迟开花的特征

2.3.3烟草突变体T-cldf的田间抗病性的初步调查结果

2.4讨论

2.5　小结

第3章　烟草突变体T-cldf及其野生型DNA多态性的AFLP分析

3.1　引言

3.2　材料与方法：

3.2.1　材料

3.2.2　烟草叶片DNA的提取

3.2.3　AFLP分析

3.3　结果与分析

3.4　讨论

3.5　小结

第4章　突变体T-cldf与其野生型叶片中差异表达ESTs的研究

4.1　引言

4.2　材料与方法

4.2.1　植物材料与文库构建技术线路

4.2.2　主要试剂盒

4.2.3　主要仪器与设备

4.2.4　烟草叶片总RNA的提取

4.2.5　SMART　cDNA合成

4.2.6　SSH

4.2.7　正向差异文库的构建

4.2.8　扣除文库的差异筛选

4.2.9　序列测定与BLAST分析

4.2.10　半定量RT－PCR分析

4.2.11　Northern杂交分析

4.3　结果与分析

4.3.1　RNA提取结果

4.3.2　SMART　cDNA的合成与RsaI酶切

4.3.3　扣除文库的构建及筛选

4.3.4　序列测定与序列信息分析

4.3.5　半定量RT－PCR分析结果

4.4　讨论

4.5　小结

论文总结

参考文献

附录1

缩略词

部分ESTs的BLAST信息

附录2：博士论文期间所从事的另一研究工作

芒果子叶生长反应因子基因MiARF2在大肠杆菌中的表达及其应用

S1.研究背景

S2.研究目的和意义

S3.材料和方法

S4.实验结果

S5.讨论

S6.存在问题

参考文献

攻读博士学位期间发表及待发表的论文

致谢

原创性声明