重症监护病房产ESBLs细菌耐药性的基础与临床研究

摘要

随着广谱抗生素的广泛应用，细菌耐药的发生率呈现出逐年上升的趋势，给临床抗感染治疗带来严峻挑战；其中，革兰氏阴性细菌产牛超广谱β-内酰胺酶(Extencled spectrum β—lactamases，ESBLs)是导致其对新型广谱抗生素产生耐药性的重要机制。近年国内外研究显示，重症监护病房(Intensive careunit，ICu)的感染病原菌中，非发酵菌所占比例逐渐升高，多重耐药性明显；但对ESBLs是否介入其耐药产生机制尚缺乏足够的认识，且检测手段有限。为此，本研究探索建立了能够适用于包括非发酵菌在内的ESBLs常规和分子牛物学检测技术，并应用于ICU病房感染病原菌产ESBLs的分子流行病学和耐药机制研究；此外，还对该类细菌的耐药特点、分子流行病学规律和医院获得性感染的危险因素进行了研究。 1．三种ESBLs检测方法的比较研究 目的：比较美国临床和实验室标准委员会(CLSI)推荐的表型筛选和确认试验、改良三维试验和ESBLs基因型特异性PCR法对临床分离株进行ESBLs检测的结果。 方法：收集2004年1-10月问，分离自ICU病房患者的深部痰的96株非重复的革兰氏阴性杆菌，包括：铜绿假单胞菌30株、嗜麦芽窄食单胞菌22株、鲍曼氏不动杆菌18株、洋葱伯克霍尔德氏菌11株、黄杆菌属10株、奇异变形杆菌2株，阴沟肠杆菌3株。采用Vitek-32全自动微生物分析系统进行菌种鉴定。应用采用美国临床和实验室标准委员会(CLSI)推荐的表型筛选和确认试验、改良三维试验和ESBLs基因型特异性PCR法分别对上述临床分离株进行ESBLs检测，McNemar x<'2>检验和Kappa检验进行统计学分析，以评价3种ESBLs检测方法的结果。 结果：CLSI法、改良三维试验和PCR法对上述菌株的ESBLs检出率分别为29.2％(28／96)、51.0％(49／96)和44.8％(43／96)。对CLSI法和改良三维试验进行比较分析，检测结果不一致部分两者具有显著性差异，改良三维试验检出率高于CLSI法(x<'2>=7.55，P=0.005)；一致性检验提示高度不一致(K=0.095，P=0.303)。对CLSI法和PCR法进行比较分析，不一致部分两者具有显著性差异，PCR法检出率高于CLSI法(x<'2>=4.170，P=0.040)；一致性检验提示高度不一致(K=-0.024，P=0.807)。将PCR方法的结果于改良三维试验比较，两者的检出率没有差别(x<'2>=1.042，P=0.307)；具有较好的一致性(K=-0.50l，P=0.000)。 结论：改良三维试验和PCR法可扩大ESBLs产酶菌种的检测范围，是对CLSI表型筛选和确认ESBLs试验的重要补充，具有临床应用的前景。 2．ICU病房产ESBLs细菌分布、基因型及其耐药性的研究 目的：探讨应用PCR和核酸测序等技术对重症监护病房革兰氏阴性杆菌产ESBLs的基因型鉴定，并对该组细菌的药敏特点进行分析，以便指导临床合理用药，减少耐药基因的产生。 方法：收集2003年1月至2004年10月间，分离自ICU病房脓毒症(Sepsis)患者下呼吸道分泌物的无重复临床分离株，共202株。包括：嗜麦芽窄食单胞菌48株、铜绿假单胞菌45株、肺炎克雷伯氏菌31株、鲍曼氏不动杆菌26株、大肠埃希氏菌9株、洋葱伯克霍尔德氏菌14株、黄杆菌属11株，其它18株。采用Vitek-32全自动微生物分析系统进行菌种鉴定。并用改良三维试验进行ESBLs产酶株的识别；PCR通用引物扩增SHV型、TEM型、CTx-M型和OXA型等常见ESBLs基因，及其克隆测序鉴定ESBLs基因型。Kirhy-Bauer法进行受试菌的药物敏感性分析。 结果：共纳入研究患者88例，平均APACHEII评分为26.2l±9.24。总的ESBLs产酶株检出率为51.5％(104／202)，依次为鲍曼氏不动杆菌80.8％(21／26)、肺炎克雷伯氏菌67.7％(21／31)、大肠埃希氏菌66.7％(6／9)、嗜麦芽窄食单胞菌41.7％(20／48)和铜绿假单胞菌33.3％(1.5／45)等。PCR法检测结果显示，受试菌中SHV型基因检出率为9.9％(20／202)、TEM型为8.4％(17／202)、CTX-M型为27.2％(55／202)和OXA型为1.0％(2／202)，以CTX-M型ESBLs最为常见。药敏分析显示，EsBLs产酶株具有多重耐药性，且对常用抗菌药物的耐药率明显高于ESBLs阴性株(P<0.05)。 结果：ICU病房患者下呼吸道感染革兰阴性菌以非发酵菌最为常见，且ESBLs检出率高，提示ESBLs为其重要耐药机制；ESBLs基因型以CTX-M型最为常见；ESBLs产酶株对常用抗菌药物的耐药率明显增高。 3．ICU病房产ESBLs铜绿假单胞菌的分子流行病学研究 目的：探讨应用分子流行病学方法对ICU病房产ESBLs铜绿假单胞菌的基因同源性进行分析，了解院内爆发感染的可能性。 方法：对7株铜绿假单胞菌分离自2004年6月至2004年8月问ICu病房的重症患者，经改良三维试验证实均产ESBLs。遂采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术进行菌株的DNA克隆分析，以了解是否存在产ESBLs铜绿假单胞菌医院内感染的爆发流行。Kirby-Bauer法进行药物敏感性分析。 结果：PFGE技术分析显示，7株产ESBLs铜绿假单胞菌中，6株菌的DNA PFGE条带基本一致，定为A型株，且具有相似的耐药谱特征，提示为同一克隆株。该克隆株对包括亚胺培南在内的所有β-内酰胺酶类抗生素耐药，仅对阿米卡星敏感。 结论：我院ICu病房存在产ESBLs铜绿假单胞菌克隆株医院内感染的爆发流行，且为多药耐药株，给临床抗感染治疗带来困难。本研究通过建立PFGE DNA克隆分型技术，为监测和控制该类耐药菌医院内感染的爆发流行提供重要的技术手段和理论依据。 4．ICU病房铜绿假单胞菌医院内感染暴发的流行病学研究 目的：探讨应用传统流行病学方法与分子流行病学方法结合在ICu病房铜绿假单胞菌院内感染 方法：对2003年3月至2005年2月问ICU病房患者感染的微生物学和临床资料进行回顾性分析，以了解铜绿假单胞菌医院内感染的变化趋势。进而实施现场取样调查，以了解患者就医环境和医护人员携带铜绿假单胞菌的情况。并对分离到的铜绿假单胞菌进行PFGE DNA克隆分型，判断克隆株的流行情况。 结果：普通病房铜绿假单胞菌的分离率为7．7％，ICU病房为17．5％(P－0．000，OR值2．534；95％可信区问2．141，2．999)。ICU病房铜绿假单胞菌的分离率由非暴发期的15．7％上升到暴发期的25．5％(P=0．000；OR值1．837；95％可信间 1．377，2．451)。ICU病房患者的铜绿假单胞菌的感染率由非暴发期的18．0％上升到暴发期的40．0％(P=0．000：OR值3．037；95％可信区间1．672，5．516)。对从20名重症者分离的铜绿假单胞菌进行PFGE分型，共获得6种PFGE分型，其中12株为A型。采取防治措施后，2004年8月ICU病房铜绿单胞菌的分离率和感染率分别回降至8．5％和15．4％。 结论： 应用传统与分子流行病学调查方法，发现了在ICU铜绿假单胞菌引起的医院感染的暴发。加强医院环境监测，及时阻断其克隆株的传播途径，是预防和控制铜绿假单胞菌医院内感染爆发流行的重要措施。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

前言

第一部分三种超广谱β-内酰胺酶检测方法的比较研究

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

第二部分重症监护病房产ESBLs细菌分布、基因型及其耐药性的研究

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

第三部分 重症监护病房产ESBLs铜绿假单胞菌的分子流行病学研究

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

第四部分重症护病房铜绿假单胞菌医院感染暴发的流行病学研究

4.1材料和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

全文总结

参考文献

附页

综述 超广谱β-内酰胺酶研究进展

致谢

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