FKBP12.6过表达对心力衰竭心室肌细胞收缩功能及离子通道电流的影响

摘要

研究背景：近年来研究发现，心力衰竭时心室肌细胞肌浆网(sarcoplasmicreticulum，SR)钙(Ca<'2+>)释放通道的稳定性受到破坏，引起SR明显的舒张期Ca<'2+>渗漏。舒张期Ca<'2+>渗漏主要导致两个严重的后果：一是SR Ca<'2+>负荷减少，以致于收缩期SR Ca<'2+>释放减少，导致收缩功能障碍；二是舒张期Ca<'2+>异常释放，激活I<,Na-Ca>，导致心肌细胞复极异常，从而产生后除极并诱发室性心律失常，甚至发生猝死。心力衰竭时心室肌细胞SR Ca<'2+>释放通道的稳定性受到破坏的原因主要是：FK506结合蛋白12.6(FK506 binding protein12.6，FKBP12.6)与兰尼受体(ryanodine receptor 2，RyR2)结合力降低。心力衰竭时交感神经张力长期增高，通过cAMP依赖蛋白激酶A途径使RyR2高度磷酸化，可导致FKBP12.6与RyR2结合力降低。Reiken等发现β受体阻滞剂治疗可逆转狗心力衰竭心室肌细胞RyR2的结构和功能障碍，增强FKBP12.6与RyR2结合力，进一步阐明了β受体阻滞剂治疗心力衰竭的分子机制。Prestle和Loughrey等发现，上调兔和大鼠心肌细胞中FKBP12.6的表达可防止舒张期Ca<'2+>渗漏，改善兴奋.收缩偶联，促进心肌细胞收缩。上述研究表明，FKBP12.6结合力降低导致的SR Ca<'2+>释放通道门控功能障碍是心力衰竭时心肌收缩力降低及室性心律失常发生的共同机制，以FKBP12.6为目标的干预可能是心力衰竭和室性心律失常治疗的一条新途径。 研究目的：本研究以心力衰竭和室性心律失常的共同机制-心室肌细胞Ca<'2+>循环异常为切入点，以SR Ca<'2+>释放通道稳定蛋白FKBP12.6为干预目标，通过腺病毒介导FKBP12.6过表达，探讨FKBP12.6过表达对心力衰竭心室肌细胞收缩功能及离子通道电流的影响，为心力衰竭和室性心律失常的防治探索新的途径。 研究方法：①重组腺病毒载体Ad.FKBP12.6-GFP的构建：将平端化的FKBP12.6片段连接到穿梭质粒pAdTrack-CMV构建重组穿梭质粒pAdTrack/FKBP12.6；采用电穿孔法将线性化pAdTrack/FKBP12.6转化AdEasier-1细菌，产生重组腺病毒质粒pAdEasy/FKBP12.6；采用脂质体介导法用线性化pAdEasy/FKBP12.6转染HEK293细胞，从病变的HEK293细胞分离、纯化重组腺病毒Ad.FKBP12.6-GFP。②大鼠心力衰竭模型的建立：采用腹主动脉结扎法建立大鼠压力超负荷增高性心力衰竭模型。③成熟心室肌细胞的分离和培养：采用Langendorff装置和Ⅱ型胶原酶分离成熟心室肌细胞，用M199培养基进行心肌细胞培养。④转基因表达的检测：Ad.FKBP12.6-GFP感染心室肌细胞后，用RT-PCR法检测FKBP12.6 mRNA的表达；用蛋白质免疫印迹、免疫荧光技术检测FKBP12.6蛋白表达。⑤采用局部场刺激和激光共聚焦显微镜线扫描分析FKBP12.6过表达对对心力衰竭心室肌细胞钙瞬变及有效不应期的影响。⑥采用采用咖啡因诱导SR储存Ca<'2+>的完全释放，通过共聚焦显微镜线扫描分析FKBP12.6过表达对对心力衰竭心室肌细胞舒张期SR.钙容量的影响。⑦采用共聚焦显微镜面扫描分析FKBP12.6过表达对心力衰竭心室肌细胞收缩功能的影响。⑧采用全细胞膜片钳技术分析FKBP12.6过表达对心力衰竭心室肌细胞主要离子通道电流的影响。研究结果：①采用细菌内同源重组技术成功构建了携带F KlBPl2.6基因的重组腺病毒载体Ad.FKBP12.6-GFP，其滴度约1.5×10<'12>pfu/ml；②采用腹主动脉缩窄法成功建立了大鼠压力超负荷增高性心力衰竭模型，术后16周左室舒张末压(LVEDP)显著升高，左室内压力的最大上升/下降速率(±dp/d<,tmax>)明显降低；③采用Langendorff装置及Ⅱ型胶原酶消化法可获得80﹪～90﹪杆状心室肌细胞，每个心脏心室肌细胞产量可达2×10<'8>；④Ad.GFP组的：FKBP12.6 mRNA表达水平显著低于正常心室肌细胞，提示心力衰竭时心室肌细胞的FKBP12.6 mRNA表达下调；Ad.FKBP12.6-GFP组FKBP12.6 mRNA表达显著增加，约为Ad.GFP组的6倍；⑤免疫荧光及免疫印迹检测发现，正常对照组FKBP12.6蛋白明显表达，Ad.GFP组的FKBP12.6蛋白表达水平显著低于正常对照组，而Ad-FKBP12.6-GFP组的FKBP12.6蛋白表达水平显著高于Ad.GFP组和正常对照组，约为Ad-GFP组的5倍；⑥在场刺激的条件下，对各组心室肌细胞进行激光共聚焦线扫描分析发现，正常对照组钙瞬变幅度(F/F<,0>峰值)显著高于Ad.GFP组(1.82±0.32 vs 1.38±0.22，p<0.05)；Ad.FKBP12.6-GFP组F/F<,0>峰值显著高于Ad.GFP组(2.53±0.38 vs 1.38+0.22，p<0.01)和正常对照组(2.53±0.38 vs 1.82+0.32，p<0.05)；正常对照组钙瞬变上升速率高于Ad.GFP组(p<0.05)，而Ad.FKBP12.6-GFP组又显著高于Ad.GFP组和正常对照组(p<0.01)；⑦正常对照组心室肌细胞的SR钙容量明显高于Ad.GFP组(F/F<,0>峰值，3.18±0.52 vs 2.34±0.44，p<0.01)；FKBP12.6过表达心肌细胞的SR钙容量显著高于Ad-GFP转染细胞(F/F<,0>峰值，4.13±0.58 vs 2.34±0.44，p<0.01)和正常对照组细胞(F/F<,0>峰值，4.13±0.58 vs 3.18±0.52，p<0.01)；⑧正常对照组心室肌细胞收缩分数明显高于Ad.GFP组(12.37±3.65﹪vs 5.24±1.78﹪，p<0.01)；FK.BP12.6过表达心肌细胞的收缩分数显著高于Ad-GFP转染细胞(16.14±3.21﹪Vs 5.24±1.78﹪，p<0.01)和正常对照组细胞(16.14±3.21﹪vs 12.37±3.65﹪，p<0.01)；⑨心力衰竭心室肌细胞I<,Na>、I<,to>和I<,CaL>较正常对照组显著降低，而I<,Ncx>则显著升高；⑩FKBP12.6过度表达可显著升高心力衰竭心室肌细胞I<,Na>、I<,to>和I<,CaL>，显著降低lNcx，从而逆转心力衰竭时上述离子通道电流的改变。研究结论：①本研究成功构建了携带FKBP12.6基因的重组腺病毒载体Ad.FKBP12.6-GFP；②心力衰竭心室肌细胞FKBP12.6表达水平明显下调，腺病毒介导的FKBP12.6基因转染可导致FKBP12.6蛋白在心力衰竭心室肌细胞中过表达；③FKBP12.6过表达可增加收缩期Ca<'2+>瞬变和舒张期SR Ca<'2+>容量，改善心力衰竭心室肌细胞的收缩功能；④FKBP12.6过表达可显著升高心力衰竭心室肌细胞I<,Na>、I<,to>和I<,CaL>，显著降低I<,NCX>，从而逆转心力衰竭时上述离子通道电流的改变。本研究为心力衰竭时心肌收缩功能的改善和室性心律失常的防治提供了新的线索和实验依据。

目录

主要英文缩写词

摘要

前 言

第一部分FKBP12.6重组腺病毒载体的构建

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第一部分 照 片

第二部分FKBP12.6过表达对心力衰竭心室肌细胞收缩功能的影响

分题一大鼠心力衰竭模型的建立及成熟心肌细胞培养

材料与方法

结 果

讨 论

分题二FKBP12.6重组腺病毒感染效率及转基因表达的检测

材料与方法

结 果

讨论

分题三FKBP12.6过表达对心力衰竭心室肌细胞收缩功能的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 照 片(1)

第二部分 照 片(2)

第三部分FKBP12.6过表达对心力衰竭心室肌细胞离子通道电流的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文结论

参考文献

附件

一、个人简历

二、在站期间发表的论文和论著

三、在站期间获得的科研基金及承担的其它课题

四、在站期间参加国内外学术会议情况

五、在站期间承担教学和/或工作情况

致 谢