SARS和弓形虫重组BCG疫苗的构建及其实验免疫研究

摘要

第一部分SARS病毒重组BCG-M疫苗的构建及其实验免疫研究.目的:1．确定SARS-CoV M蛋白的免疫原性；2．构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000-M；3．明确M蛋白在耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis mc<'2>155中的表达及其免疫原性；4．观察重组BCG-M诱导的免疫效应并探讨其免疫机制。 方法:1．构建M蛋白重组原核表达质粒pET-M，SDS-PAGE分析M蛋白在大肠杆菌中的表达，以SARS病人恢复期血清行Westem blot分析重组蛋白的免疫原性；2．克隆M蛋白基因，插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000，构建成重组穿梭表达质粒pBCG3000-M；3．将重组质粒pBCG3000-M电转化耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis mc<'2>155构建耻垢疫苗株Msmc<'2>155-M，热诱导表达M重组蛋白，Western blot分析其免疫原性。重组Msmc<'2>155-M免疫BALB/c小鼠，观察其特异性抗体的产生；4．重组质粒pBCG3000-M电转化BCG构建重组疫苗BCG-M，以不同的免疫次数(1次和3次)、不同的免疫途径(皮下和腹腔注射)免疫BALB/c小鼠，以ELISA、Western blot、MTT、FCM、ELISPOT(enzyme-linkedimmunospot assay)、ICS(intracellular cytokine staining)等免疫学方法观察特异性体液免疫和细胞免疫的产生，并以组织核菌量和组织病理学改变评价重组疫苗的安全性。 结果 1．经IPTG诱导后重组pET-M菌体外表达了M重组蛋白，裂解细菌，金属鳌和纯化目的蛋白，纯化的蛋白可被SARS病人恢复期血清特异识别，表明M蛋白具免疫原性。 2．经PCR、限制性内切酶消化及测序鉴定，证实成功构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000-M。 3．重组耻垢分枝杆菌株Msmc<'2>155-M经热诱导表达约25kDa的特异蛋白带，可被SARS患者恢复期血清及Msmc<'2>155-M免疫鼠血清识别，证明M蛋白可在分枝杆菌M. smegmatis mc<'2>155中获得表达，并具生物学活性。重组菌Msmc<'2>155-M皮下免疫BALB/c小鼠后，观察到高滴度特异性抗体的产生。 4．重组BCG-M以不同免疫次数和免疫途径接种BALB/c小鼠后，均观察到特异性体液和细胞免疫的产生。ELISA和Western blot结果示免疫小鼠产生高滴度的特异性抗体；MTT结果表明小鼠脾淋巴细胞增殖明显；FCM结果示CD8<'+>T淋巴细胞亚群在免疫后第8周明显升高；脾淋巴细胞经特异性抗原M蛋白刺激诱导后分泌IFN-γ和IL-2量较对照组高，IL-4、IL-10和TNF-α分泌量在各组间无显著性差别；IFN-γEIdSPOT示免疫组小鼠第4W脾细胞经刺激培养后，孔中IFN-γ特异性分泌细胞斑点数较：PBS和BCG组对照组显著增加，但BCG-pBCG3000对照组亦增加明显，两组间无显著差异；ICS结果示IFN-γ特异性分泌的CD8<'+>CTL百分比随时间有上升的趋势，提示免疫小鼠特异性T淋巴细胞的分化有时间规律，应延长观察时间进一步确定；对疫苗安全性的观察结果示，免疫后小鼠脏器组织荷菌量与对照组比较没有显著增加，也未观察到明显的组织病理学改变。 结论 1．M蛋白是有效的抗原靶蛋白；2．成功构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000-M；3．M蛋白可在分枝杆菌M.smegmatis mc<'2>155中获得表达，表达蛋白具生物学活性。重组菌Msmc<'2>155-M可诱导小鼠产生特异性体液免疫反应；4．成功构建BCG-M疫苗，在BALB/c小鼠体内可诱导产生包括体液免疫和细胞免疫的全面的机体免疫反应，尤其观察到特异性CD8<'+>CI、L，免疫反应倾向于Thl型；5．BCG-P35疫苗安全，无明显的组织病理损害。 第二部分弓形虫重组BCG-P35疫苗的构建及其实验免疫研究.目的:1．构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000-P35；2．明确P35蛋白在耻垢分枝杆菌Mycobacterium．Smegmatis mc<'2>155中的表达及其免疫原性；3．观察重组BCG-P35疫苗诱导的小鼠抗弓形虫感染的免疫保护力并探讨其免疫效应机制，评价重组BCG疫苗的安全性；4．构建重组酵母菌Yeast-P35，观察其诱导的免疫保护力及对重组BCG-P35疫苗的免疫佐剂效应。 方法 1．克隆P35蛋白基因，插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000，构建成重组穿梭表达质粒pBCG3000-P35； 2．将重组质粒pBCG3000-P35电转化耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis mc<'2>155构建耻垢疫苗株Msmc<'2>155-P35，热诱导表达P35重组蛋白，Western blot分析其免疫原性。重组Msmc<'2>155-P35免疫BALB/c小鼠，观察其特异性抗体的产生； 3．重组质粒pBCG3000-P35电转化BCG构建重组疫苗BCG-P35，以不同的免疫次数(1次和3次)、不同的免疫途径(皮下和腹腔注射)免疫BALB/c小鼠，以ELISA、Western blot、MTT、FCM、ELISPOT、ICS等免疫学方法观察特异性体液免疫和细胞免疫的产生，并以组织核菌量和组织病理学改变评价重组疫苗的安全性。以弓形虫速殖子攻击感染免疫小鼠，观察小鼠存活时间以评价疫苗的免疫保护力；4．构建重组酵母表达质粒pPICZαA-P35，转化Pichia pastoris构建重组酵母菌Yeast-P35。以整体重组菌Yeast-P35腹腔注射免疫BALB/c小鼠观察其诱导的免疫保护力或与BCG-P35同时免疫观察其免疫佐剂效应。 结果 1 经PCR、限制性内切酶消化及测序鉴定，证实成功构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000-P35。 2 重组耻垢分枝杆菌株Msmc<'2>155-P35经热诱导表达约28kDa的特异蛋白带，可被弓形虫兔感染血清识别，证明P35蛋A可在分枝杆菌M.smegmatismc<'2>155中获得表达，并具生物学活性。重组菌Msmc<'2>155-P35皮下免疫BALB/c小鼠后，观察到高滴度特异性抗体的产生。 3 重组BCG-P35以不同免疫次数和免疫途径接种BALB/c小鼠后，均观察到特异性体液和细胞免疫的产生。 结论 1.成功构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000-P35；2.P35蛋白可在分枝杆菌M.smegmatis mc<'2>155中获得表达，表达蛋白具生物学活性。重组菌Msmc<'2>155-P35可诱导小鼠产生特异性体液免疫反应；3.成功构建BCG-P35疫苗，在BALB/c小鼠体内可诱导产生包括体液免疫和细胞免疫的全面的机体免疫反应，尤其观察到特异性CD8<'+>CTL，免疫反应倾向于Th1型；4.重组BCG-P35可诱导小鼠产生一定的抗弓形虫感染的免疫保护力；5.BCG-P35疫苗安全，无明显的组织病理损害；6.本研究中未观察到整体酵母菌Yeast-P35在BALB/c小鼠的免疫保护或免疫佐剂效应。

目录

论文说明：缩略词表

第一部分SARS重组BCG-M疫苗的构建及其实验免疫研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分弓形虫重组BCG-P35疫苗的构建及其实验免疫研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

个人简历

致谢