血小板生成素受体（Mpl）与其新配体hNUDC相互依赖关系及其功能研究

摘要

血小板生成素(Thrombopoitin，TPO)是刺激巨核细胞增殖与分化的主要细胞因子，通过其受体Mpl的结合作用调节血小板生成。但是研究表明，在TPO基因敲除的小鼠中，巨核细胞和血小板虽然减少90﹪，但小鼠仍然正常发育，这提示除TPO外，还有其他的代偿机制或有未发现的Mpl配体蛋白存在，与TPO一起调节血小板生成。 本实验室利用酵母双杂交系统(Yeast two hybrid system)，以Mpl的胞外区域为诱饵，筛选人胎肝cDNA文库，获得的一个与Mpl相互结合的蛋白，序列分析表明该蛋白为人核迁移蛋白hNUDC。通过一系列的体内体外实验，证明该蛋白为Mpl的另一枚配体。 为了进一步确定Mpl与TPO、hNUDC两个配体的结合部位，本实验根据Mpl结构特点进行缺失突变，构建酵母双杂交系统及融合荧光蛋白的真核表达载体，分别在酵母细胞和哺乳动物细胞中进行了实验。在酵母双杂交系统中，将Mpl系列区克隆在酵母双杂交系统诱饵质粒pGBKT7上，将TPO及hNUDC克隆于pGADT7上，在酿酒酵母菌株AH109中进行酵母双杂交反应。对报告基因的检测表明，Mpl的两个配体TPO及hNUDC均与Mpl的CRM1中靠近细胞膜端。同时用构建的缺失Mpl膜外相关区、融合绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体，hNUDC、TPO融合红色荧光蛋白(DsRed1)表达载体，共转染NIH3T3细胞、稳定表达Mpl特异区蛋白的NIH3T3细胞进行ELISA、免疫共沉淀研究，进一步确定TPO、hNUDC与Mpl结合部位在Mpl-D1-S2区，与酵母双杂交结果一致。该区域含有造血细胞因子受体的特征氨基酸序列Trp-Ser-Xaa-Trp-Set(即WSXWS box)的退化序列WGXWS及一段Mpl特异的序列“插入区”，表明WGXWS序列以及插入区对Mpl与配体的结合起关键的作用。确定hNUDC、TPO与Mpl作用部位后，我们以NIH3T3细胞作为模式细胞，用hNUDC蛋白体外处理无血清培养的、稳定表达Mpl、Mpl-D1、Mpl-D2、Mpl-D1-S1、Mpl-D1-S2、EGFP的NIH3T3细胞，MTT法分析hNUDC蛋白对细胞活力影响，结果发现，hNUDC蛋白可以提高稳定表达Mpl、Mpl-D1、Mpl-D1-S2的NIH3T3细胞活力。为了进一步研究hNUDC与Mpl及不同区域蛋白的相互影响作用，用融合绿色荧光蛋白基因的pMpl-EGFP、pMpl-D1-EGFP、pMpl-D1-S2-EGFP真核表达载体DNA与融合红色荧光蛋白基因的phNUDC-DsRed1真核表达载体DNA共转染NIH3T3细胞，以及利用hNUDC蛋白进一步体外处理稳定表达Mpl、Mpl-D1、Mpl-D1-S2蛋白的Mpl-EGFP-NIH3T3细胞、Mpl-D1-EGFP-NIH3T3细胞及Mpl-D1-S2-NIH3T3细胞，结果表明，hNUDC可以改变稳定表达Mpl、Mpl-D1、Mpl-D1-S2蛋白的NIH3T3细胞的细胞形态，形成巨核、多核，使细胞具有巨核细胞分化的一些特征；hNUDC蛋白体外可以诱导稳定表达Mpl、Mpl-D1、Mpl-D1-S2蛋白的NIH3T3细胞ERK、P38蛋白磷酸化，引起ERK、P38信号转导作用。用phNUDC-DsRedl载体转染表达Mpl的NIH3T3细胞，用高尔基体、内质网及微管荧光抗体标记高尔基体、内质网和微管，发现Mpl可以通过内质网及微管系统介导hNUDC蛋白的分泌作用。共转染也发现Mpl-D1-S2能介导hNUDC蛋白的分泌作用。 总之，本论文确定了hNUDC、TPO与Mpl的结合部位，研究了Mpl及不同区域与hNUDC在细胞中的相互作用影响，可为进一步研究巨核细胞分化发育及血小板产生的作用机制，提供实验和理论依据。

目录

文摘

英文文摘

第1章文献综述

1.1血小板生成素(TPO)及其受体Mpl的研究

1.2核迁移蛋白NUDC的研究进展

1.3 MAPK研究进展

1.4酵母双杂交系统

1.5绿色荧光蛋白

1.6本课题前期研究背景

第2章酵母双杂交确定Mpl与TPO及hNUDC相互作用的部位

2.1前言

2.2实验材料

2.3实验方法

2.4实验结果

2.5讨论

第3章Mpl及相关功能区与TPO、NUDC在NIH3T3细胞中的结合作用

3.1前言

3.2实验材料

3.3实验方法

3.4实验结果

3.5讨论

第4章hNUDC对特异性表达Mpl及各功能区基因的NIH3T3稳定细胞的影响作用

4.1前言

4.2实验材料

4.3实验方法

4.4实验结果

4.5讨论

总结与展望

参考文献

附录ⅠMpl碱基序列/氨基酸序列

缩略词表

附录Ⅱ作者攻读学位期间发表的论文和参加的课题

致谢

论文原创性声明