小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474对鼻咽癌模型的抗肿瘤作用及机制研究

摘要

鼻咽癌是中国华南地区及东南亚地区常见的头颈部恶性肿瘤，好发于40～60岁，男性患者为女性的3.5倍。放射治疗是目前鼻咽癌唯一的根治性治疗手段。然而，鼻咽癌确诊时75﹪的患者属于中晚期，中晚期鼻咽癌治疗失败的主要原因是局部复发和远处转移。据统计，中晚期鼻咽癌患者首次放疗后的局部复发率为10.2﹪～15.75﹪，再放疗后5年的生存率为23.0﹪。为进一步改善局部晚期鼻咽癌的预后，近年来化学治疗、外科挽救性手术治疗已越来越多地介入到鼻咽癌的治疗中。但即使放疗联合顺铂化疗患者的5年生存率也不容乐观。因此，迄需研发新的治疗方法。 ZD6474(Zactima<'TM>、Vandetanib)是一种苯胺基喹唑啉化合物，为口服的小分子酪氨酸激酶抑制剂，由AstraZeneca制药公司研发，目前处于Ⅲ期临床试验阶段。该药物可高选择性抑制血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2/KDR)酪氨酸激酶活性(IC<,50>=0.04μM)，阻断血管内皮细胞生长因子(VEGF)介导的内皮细胞信号转导从而抑制血管生成。研究表明ZD6474通过这种广谱的抗血管生成作用可以抑制多种不同组织来源的恶性肿瘤裸鼠移植瘤模型生长。此外，ZD6474还可以抑制表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶活性(IC<,50>=0.5μM)。 已经发现多种恶性肿瘤中有EGFR或其配体的过度表达，异常高活性的EGFR酪氨酸激酶与肿瘤细胞的增殖、存活、转移及分泌促血管生成因子密切相关。因此，ZD6474有望通过选择性抑制VEGFR2和EGFR酪氨酸激酶双靶点遏制肿瘤生长。 本课题主要对ZD6474对鼻咽癌的抗肿瘤作用及其机制进行了研究。我们首先采用RT-PCR和Western blot的方法分析了三株鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2和C666-1中VEGFRl、VEGFR2和EGFR的表达情况。结果表明，三株鼻咽癌细胞中均未检测到VEGFR1和VEGFR2的表达，而EGFR蛋白在三株细胞中的相对表达量分别为1.1、1.23和0.66。接下来，我们以3gM ZD6474处理CNE-1、CNE-2和C666-1细胞，采用IP-WB及Western blot方法检测到ZD6474可明显抑制这三株鼻咽癌细胞中的EGFR酪氨酸激酶磷酸化并抑制其下游信号通路中ERK<,1/2>和Akt磷酸化。MTT法检测ZD6474对鼻咽癌细胞活力的影响，结果显示ZD6474作用于CNE-1、CNE-2和C666-1细胞72小时，其抑制细胞生长增殖的IC<,50>值分别为2.3μM，3.6μM和4.86μM。流式细胞分析术显示，ZD6474抗鼻咽癌细胞增殖作用与诱导细胞G0/G1期阻滞有关，6μMZD6474处理CNE-1、CNE-2细胞24小时或9μM ZD6474处理C666-1细胞24小时，处于G0/G1期的细胞分别由52.3±6﹪，45.24±10.2﹪和54.9±1.3﹪提高至79.4±6.9﹪，59.9±7.6﹪，和58.7±1.5﹪(P<0.05)，同时伴随处于S期和G2-M期细胞的减少。进一步以无血清RPMI 1640培养C666-1细胞24小时，使其形成生长同步化。随后使用含10﹪胎牛血清的RPMI 1640配制浓度9gM的ZD6474处理C666-1细胞，流式细胞仪分析细胞周期的进展。结果显示，ZD6474可显著延迟C666-1 G0/G1期进展(P<0.05)，ZD6474作用于细胞16小时后仍有70.7﹪细胞停留在G0/G1期，与之相比，未受到Z6474处理的细胞仅有60.3﹪停留在G0/G1期；ZD6474作用于细胞24小时，有69﹪处理组细胞处于G0/G1期，而未处理组仅有53.5﹪细胞处于G0/G1期。分子机制研究表明，ZD6474通过上调细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂p21、p27及下调细胞周期素依赖性蛋白激酶CDK2、CDK4或CDK6诱导鼻咽癌细胞停滞在细胞周期的G0/G1期。在明确了ZD6474诱导鼻咽癌细胞G0/G1期阻滞后，我们希望进一步探明ZD6474是否诱导鼻咽癌细胞凋亡。 ZD6474处理鼻咽癌细胞72小时，流式细胞仪检测到在CNE-1和CNE-2细胞有subG1峰的出现，提示ZD6474可能诱导鼻咽癌细胞凋亡。为了进一步证实此结果，我们采用Annexin-V/7-AAD双染方法进行检测。结果显示ZD6474可以剂量依赖方式诱导CNE-1和CNE-2细胞凋亡。以CNE-2细胞为例，ZD6474处理CNE-2细胞48小时，对照组及1.5-6μM ZD6474处理组早期凋亡细胞比例分别为2.5±1.2﹪、5.0±0.4﹪、6.8±1.8﹪和12.7±1.8﹪(对照组对处理组P<0.05)；晚期凋亡细胞比例分别0.5±0.2﹪、3.1±0.6﹪、9.6±1.4﹪和12.2±1.1﹪(对照组对处理组P<0.05)。Western blot和caspases酶活力检测显示ZD6474诱导CNE-1细胞凋亡主要由下调抵抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-X1表达、上调促进凋亡分子Bak和Bax表达、激活caspase-9、caspase-8和caspase-3参与；而ZD6474诱导CNE-2细胞凋亡则主要由上调促进凋亡分子Bak和Bax表达、激活caspase-9和caspase-3参与。体内实验，以25-100mg/kg/d ZD6474灌胃给药，每日一次，连续25日，可显著抑制CNE-2及C666-1移植瘤的生长(P<0.05)，并延长荷瘤小鼠生存期。在CNE-2裸鼠移植瘤模型，25mg/kg/d组、50mg/kg/d组及100mg/kg/d组抑瘤率分别为33.5﹪、47.3﹪和86.4﹪；中位生存期从32±1.9天分别延长至36±1.6天、46±2.4天、60±3.2天。在C666-1裸鼠移植瘤模型，25mg/kg/d组、50mg/kg/d组及100mg/kg/d组抑瘤率分别为43.6﹪、57.1﹪和91.5﹪；中位生存期从38±1.6天分别延长至43±2.4天、55±4.7天、68±5.5天。免疫组化分析裸鼠移植瘤组织显示，ZD64.74给药组肿瘤MVC显著减少，Ki67染色阳性细胞显著减少，肿瘤细胞分泌促血管生成因子VEGF显著减少。结论：ZD6474可通过阻滞细胞于G0/G1期、诱导细胞凋亡发挥抗鼻咽癌细胞生长增殖作用，并显著抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤生长。因此，ZD6474有望成为鼻咽癌治疗的新疗法。

目录

文摘

英文文摘

引言

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

小结与展望

图表（一）

图表（二）

图表（三）

参考文献

缩写词

附录

致谢

原创性声明