地塞米松对体外培养人眼小梁细胞连接蛋白表达和细胞骨架的影响研究

摘要

目的 本研究通过体外培养人眼小梁细胞，将地塞米松作为激素性处理因素，分子生物学方法检测体外培养的人眼小梁细胞紧密连接蛋白ZO-1和间隙连接蛋白Cx43表达的变化及Actin骨架形态结构的变化。旨在从新的角度解释房水流出阻力的调节机制，为GIG和POAG的发病机理的研究提供新的思路，为探讨其治疗措施提供新的方向。 方法 1.人眼小梁细胞的体外培养和鉴定：用组织块培养法培养正常人小梁细胞(NTM)及POAG患者小梁细胞(GTM)，传代培养永生化小梁细胞株(iHTM，加拿大Vincent Raymond教授惠赠)，显微镜观察、免疫细胞化学等方法鉴定小梁细胞。 2.激素处理小梁细胞：将细胞分为对照组和处理组，处理组细胞培养液添加10mol/L地塞米松进行培养观察细胞连接蛋白表达的改变，处理组细胞培养液添加5<'*>10<'-7>mol/L地塞米松进行培养观察细胞骨架形态变化。 3.小梁细胞ZO-1、Cx43蛋白表达的检测：应用免疫荧光细胞化学，RT-PCR、Westem blot方法分别从mRNA水平和蛋白水平检测小梁细胞ZO-1、Cx43的表达。 4.小梁细胞骨架形态的检测：应用免疫荧光细胞化学检测小梁细胞Actin骨架形态的改变。 结果 1.小梁细胞体外培养结果成功体外培养正常人眼、POAG患者及永生化小梁细胞，镜下可见：POAG患者与正常人，地塞米松处理组与对照组小梁细胞形态、分布上未见明显差别。 2.小梁细胞连接蛋白表达检测结果 1) 免疫荧光细胞化学结果显示Dex处理2天后，人眼小梁细胞ZO-1、Cx43蛋白分布无明显变化，均定位于相邻细胞边界； 2) RT-PCR结果显示各组小梁细胞在mRNA水平均有ZO-1、Cx43的表达；其中ZO-1存在两种亚型α+/α-，ZO-1α+比α-表达量少； 3) Westem blot结果显示各组小梁细胞在蛋白水平均有ZO-1、Cx43表达。 对于正常人眼小梁细胞，只检测到ZO-1一种亚型α-和Cx43表达。Dex处理4天时间内随着时间的延长各组细胞两种蛋白的表达均呈上升趋势，相同时间点地塞米松处理组两种蛋白的表达量明显较对照组高；Dex处理5天后，随着时间的延长各组细胞两种蛋白的表达均呈下降趋势，相同时间点地塞米松处理组两种蛋白的表达量明显较对照组低。 对于POAG患者小梁细胞，检测到ZO-1两种亚型α+/α-和Cx43表达。两种蛋白随着时间延长表达先呈上升趋势， Dex处理6天左右，随着时间的延长各组细胞两种蛋白的表达均呈下降趋势；相同时间点地塞米松处理组ZO-1a+和Cx43蛋白的表达量明显较对照组高。 3.小梁细胞骨架形态检测结果 1) 免疫荧光细胞化学结果显示正常人眼小梁细胞的DEX处理组可见CLANs结构形成而对照组未见此结构存在； 2) CLANs结构可见于未加Dex处理的GTM和iHTM小梁细胞，而DEX处理组CLANs结构形成明显增多。 2.ZO-1α+在GTM的表达可能与POAG患者小梁网部位房水流出阻力增加有关。 3.Dex可以诱导体外培养人眼小梁细胞Actin骨架重构形成CLANs结构，DEX可以改变紧密连接相关蛋白ZO-1和间隙连接蛋白Cx43的表达，可能在小梁网部位房水流出阻力调节中具有重要作用。

目录

文摘

英文文摘

前 言

材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

实验结果

1.人眼小梁细胞的体外培养与鉴定结果

1.1体外培养人眼小梁细胞的形态特征

1.2体外培养人眼小梁细胞的免疫细胞化学鉴定

2.地塞米松对人眼小梁细胞连接蛋白表达的影响

2.1光镜下小梁细胞形态观察

2.2免疫荧光细胞化学检测ZO-1和Cx43在人眼小梁细胞的表达分布

2.3 RT-PCR方法检测ZO-1和Cx43在人眼小梁细胞mRNA水平的表达

2.4 Western blot方法检测ZO-1和Cx43在人眼小梁细胞蛋白水平的表达

3.地塞米松米对人眼小梁细胞骨架形态的影响

3.1人眼小梁细胞Actin骨架和黏附连接vinclulin表达检测

3.2 DEX对人眼小梁细胞Actin骨架形态影响检测

讨论

结论

问题与展望

参考文献

英文缩写词表

附录

致 谢

原创性声明