ATRA影响结肠癌LoVo细胞化疗药物敏感性及Survivin基因表达的研究

摘要

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是人类消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率就全球而言仍然在不断上升，全世界每年以2﹪的速度增长，成为严重威胁着人类的健康的顽疾之一。治疗上，目前仍以手术、术后辅助化疗、放疗等为主，但总的治疗效果还不令人满意。随着ATRA(all-trans retinoicacid，全反式维甲酸)在急性早幼粒细胞白血病治疗中的成功，诱导分化作为防治恶性肿瘤的新途径，在恶性肿瘤治疗中的地位已被确立。随后人们开始了诱导分化治疗实体瘤的探索，并取得了初步成效。本课题从ATRA对肿瘤细胞增殖周期的影响出发，结合临床常用化疗药物的作用特点，考虑将诱导分化治疗与化疗相结合，利用ATRA将肿瘤细胞诱导至某一特定增殖周期，然后加用周期特异性化疗药物进行化疗，以期通过诱导分化与化疗的结合而达到集中杀伤或诱导肿瘤细胞凋亡的目的。近年的研究结果提出了凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要模式，而IAP家族在调节肿瘤细胞对凋亡敏感性方面起着核心作用。Survivin作为一种新近发现的结构独特的IAPs成员，不但同时具有共同调控细胞周期和细胞凋亡的双重功能，而且同某些肿瘤细胞的化疗药物敏感性密切相关。因此，本课题旨在通过对ATRA影响结肠癌Lovo细胞化疗药物敏感性的研究探讨以ATRA为代表药物的诱导分化联合化疗用于结直肠癌治疗可行性，并对结肠癌LoVo细胞内Survivin的表达情况进行检测，分析其分子生物学机制，为该方案的进一步临床应用提供理论依据。方法与结果一、流式细胞术检测不同浓度ATRA作用后LoVo细胞的周期分布情况： 实验方法：结直肠癌LOVo细胞传代培养至80﹪融合时，传代并接种至A、B、C、D四个培养瓶中，分设对照组、10<'-5>、10<'-6>、10<'-7>Tmol ATRA组，当各组细胞培养至指数生长期时换液，分别加入RPMI-1640培养液及含有相应浓度ATRA的培养液，继续培养，分别于培养后24hr、48hr、72hr、第5天、第7天、传二代、传四代后收集各组培养瓶中的LoVo细胞，消化并制备单细胞悬液，调整细胞浓度在1×10<'6>/ml。依试剂盒说明书加入相应药物，上机进行流式细胞仪检测，细胞周期分析显示细胞周期分布，计算SPF值。并将数据输入SPSS11.0 forWindows系统，应用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行分析。 结果： (1) 对照组中在不同时间点G0/G1期细胞比例有显著差异(P<0.05)(2) 实验各组中72hr内在不同时间点G0/G1期细胞比例无显著性差异(P>0.05)，72hr后不同时间点G0/G1期细胞比例有显著性差异(P<0.05)。 (3) 对照组与实验组各时间点G0/G1期细胞比例有显著性差异(P<0.05)，其中传代前即120hr内，10<'-5>及10<'-5>浓度组在各时间点G0/G1期细胞比例无显著性差异(P>0.05)，<'-5>浓度组与<'-5>及<'-5>浓度组120hr内各时间点G0/G1期细胞比例有显著性差异(P<0.05)，传代后各浓度组在各时间点的G0/G1期细胞比例有显著性差异(P<0.05)。 结论：不同浓度的ATRA作用后， G0/G1期的LoVo细胞比率增高， S期与G2/M期的细胞比率相应降低，随时间延长，G0/G1期细胞比例逐渐下降；72hr内10<'-5>及10<'-6>浓度组G0/G1期细胞比例高于对照组及10<'-7>组，而10<'-5>及10<'-6>组该期细胞比例无明显差异。可以考虑选择10<'-6>mol/LATRA作用48hr作为联合用药的最佳方案选择。 二、应用MTT比色法检测LoVo细胞存活率，分析ATRA对细胞化疗药物敏感性的影响： 实验方法：将培养至80﹪融合的LoVo细胞接种于96孔板，分为ATRA及空白对照两个大组，每组中分设：5-FU组(0、2mg/ml、4 mg/ml、6 mg/ml)及MMC组(0、200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml)，每组设3个复孔。细胞常规培养至指数生长期时换液，对照组继续用RPMI-1640培养，实验组改用含有相应浓度ATRA或化疗药物的培养液培养。分别培养24hr后加入MTT及DMSO，然后酶联仪检测570nm波长的吸光度值(OD值)，结果输入SPSS11.0 for Windows软件，应用析因设计的方差分析对数据进行处理，并绘制ATRA与不同浓度5-FU及MMC的交互效应图。 结果：(1) 横向比较：除MMC(600ug/ml)外，5-FU及MMC各浓度水平中，实验组与对照组相比p<0.05； (2) 纵向比较：a：实验组中，除MMC组400ug/ml同600ug/ml浓度水平相比p>0.05外，5-FU及MMC各个浓度组OD值相比P<0.05。b：对照组中，5-FU：2.0mg/ml浓度水平5-FU同4.0以及4.0与6.0mg/ml浓度水平的OD值相比p>0.05；2.0与6.0mg/ml浓度水平的OD值相比p<0.05：MMC：200 ug/ml浓度水平MMC同400及400、600ug/ml浓度水平相比p<0.05。 (3) 交互效应图显示ATRA分别与不同浓度的5-FU及MMC存在交互效应，联合用药具有协同作用。 结论：ATRA可增强结肠癌LoVo细胞对5-FU及MMC的敏感性，联合用药具有协同作用。 三、丫啶橙结合溴化乙锭染色荧光显微镜观察凋亡细胞形态学改变： 实验方法：将80﹪融合的结直肠癌LoVo细胞传代接种到6孔培养板上，分别设对照组、10<'-6>ATRA、5-FU(4.0mg/ml)、MMC(400ug/ml)及10<'-6>ATRA+5-FU(4.0mg/ml)、10<'-6>ATRA+MMC(400ug/ml)组，分别以RPMI-1640培养液和含有相应浓度ATRA和(或)化疗药物的培养液培养。分别将培养24hr后LoVo细胞制成单细胞悬液，细胞计数调整细胞浓度在1×10<'7>/ml，取5ul细胞悬液滴于载玻片上，加10ul荧光染色液(0.01﹪的丫啶橙和溴化乙锭各5ul)染色1min。荧光显微镜下观察，以出现细胞体积缩小，核固缩，染色质浓集和凋亡小体形成判定为凋亡细胞。结果与结论：各组LoVo细胞于用药24hr后出现典型的凋亡细胞形态学改变：细胞体积缩小，核固缩，荧光染色增强以及凋亡小体形成。联合用药组细胞凋亡更明显。 四、免疫荧光法测定Survivin表达： 实验方法：将80﹪融合的结直肠癌LoVo细胞传代接种到6孔培养板(孔内放置无菌盖玻片一张)中，分设对照组、10<'-6>mol ATRA组，每组设3个复孔，分别以RPMI-1640培养液和含有相应浓度ATRA的培养液培养48hr。待细胞贴壁生长后，将盖玻片取出以丙酮固定30min，PBS液冲洗，加入滴度为1：200的兔抗人Survivin多克隆抗体，室温下放置30min，冲洗后加入FITC标记的兔抗羊抗体室温下孵育l小时，PBS冲洗10min，封片后荧光显微镜下观察。结果判定：以细胞内出现5﹪以上的荧光为阳性，每片观察3个高倍镜视野(400×)，对视野内的细胞进行绝对计数，并由此计算出阳性百分比。 结果：ATRA作用前结肠癌LoVo细胞Survivin的表达率为33.33﹪，ATRA作用48hr后Survivin的表达阳性率为27.96﹪，二者差异有统计学意义。 结论：ATRA抑制了结肠癌LoVo细胞Survivin的表达。 全文结论： (1)不同浓度的ATRA作用后G0/G1的LOVo细胞比率增高，而S期与G2/M期细胞比率相应降低，随时间延长，G0/G1期细胞比例逐渐下降，72hr内10<'-5>及10<'-6>浓度组G0/G1期细胞比例高于对照组及10<'-7>组，而10<'-5>及10<'-6>组该期细胞比例无明显差异。 (2) MTT检测结果显示ATRA分别与5-FU、MMC联合应用后细胞存活率降低，上述药物联合具有协同作用，可以认为ATRA增加了结肠癌LoVo细胞对化疗药物5-FU、MMC的敏感性；对结肠癌LoVo细胞而言，ATRA+MMC用药方案优于ATRA+5-FU方案。 (3) ATRA分别与5-FU、MMC联合应用于结肠癌LoVo细胞后出现典型的细胞凋亡的形态学改变：细胞核体积缩小，核固缩，荧光染色增强以及凋亡小体形成。 (4) ATRA作用后Survivin在结肠癌LoVo细胞中表达受抑制，结合相关文献，可以认为ATRA增强结肠癌对5-FU、MMC的敏感性可能与Survivin的表达受抑制有关。

目录

文摘

英文文摘

背景与前言

材料与方法

结 果

讨论

全文结论

参考文献

附录一：结直肠癌TNM分期-UICC 2002第六版

附录二 中英文对照表

致谢

原创性声明