加味补阳还五汤防治兔髂动脉球囊损伤后狭窄的实验研究

摘要

自1977年Gruentzig开展第1例经皮腔内冠状动脉成形术(Percutaneous Tran-sIuminal Coronapy Angioplasty，PTcA)以来，PTCA已作为有效治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的一种方法广泛应用于临床，成为心血管病介入治疗的丰要手段之一。但此后20余年间PTCA后冠状动脉甲．期再狭窄(Restenosis，RS)的发生率据报道可高达30﹪～50﹪，一直是网扰医学界的一大难题，也是近年来临床和基础研究的热点。 RS的确切发病机制至今仍未完全明了，目前认为可能与血管内膜增殖、血管重塑和弹性回缩有关，另外，局部的炎性免疫反应、感染和血管外膜纤维化等因素也起着一定的作用，还有其它如细胞因子、生长因子、血管和血细胞成分相互作用等多种因素参与。从实质上说，RS是局部血管损伤后的一种修复反应。 转化生长因子-β 1(Transforming growth factor-β，TGF-β)是血管平滑肌细胞(Vascular smooth mUscle cell，VSMC)增殖、迁移和凋亡的有力调节因子，能促进细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)分泌以及外膜成纤维细胞增殖、迁移和表型转化，参与血管损伤后内膜增殖和血管重塑，在PTCA后RS病理过程中起到重要作用。 一氧化氮(N0)是L-精氨酸(L-mg)经NO合酶(NOS)作用产生的血管舒张因子，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达及NO的释放，能抑制vSMC的迁移、增殖并促其凋亡，在多个环节抑制Rs的形成。 氧化应激作为炎症免疫反应的显著标志与动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)及PTCA后RS的发生关系密切，抗氧化损伤可抑制RS的发生。 如何减少PTCA后RS的发生一直是研究的热点。迄今大约有50多个精心设计的临床试验分别应用抗血栓、抗炎症、抗VSMC迁移增殖及调脂等药物持续8～10年的观察结果并没有肯定证明它们有明显降低Rs发生率的作用。冠脉内支架植入术在一定程度可降低RS发生率，但术后RS仍然高达20﹪-30﹪。药物洗脱支架(DES)预防RS是近年来研究比较热门的课题，临床观察发现DES后RS的发生率明显降低，小于10﹪，但是有迟发性支架内血栓形成的风险，而且死亡率高。基因治疗可望成为治疗RS的手段之一，但目前尚处于试验阶段，还有许多理论、技术、伦理等方面的问题要攻克。因此寻找一种能有效防治PTCA后RS的药物是目前冠脉介入治疗的当务之急。 补阳还五汤(Buyang Huanwu Decoction，BHD)出自清代名医王清任的《医林改错》，由黄芪、当归、川芎、赤芍、桃仁、红花、地龙七味药组成。现代医学研究证实BHD具有抗氧化应激、抗血小板、保护和修复血管内皮细胞(VEC)功能、改善冠脉循环、抗实验性As及抗PTCA后RS等多种作用，加味BHD系原方基础上加生山楂，三七而成，在保持原有疗效同时，更具有降脂、抑制VSMC增殖等功效，因此，我们推测加味BHD在防治PTCA后RS方面起着重要作用。 研究目的： 迄今，围外尚无有关BHD防治PTCA后RS的报道，在谢氏及侯氏的研究中，他们建立的是胸、腹主动脉RS模型，主要从影响血小板衍化生长因子受体(Platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)基因和超氧化物歧化酶(SOD-1)基因表达方面探讨药物作用机制。本研究通过建立髂动脉内膜损伤模型，观察加昧BHD对球囊损伤后动脉内膜的保护和修复作用，以及对TGF-β 1、NO系统和氧化应激的影响，探讨加味BHD对兔髂动脉球囊损伤后狭窄的防治作用及其可能机制，为加味BHD用于临床防治PTCA后RS提供新的实验及理论依据。 材料与方法： 雄性新西兰大白兔24只，兔龄4个月，体重2.0～2.5kg，随机分为假手术组、模型组及药物组，每组各8只。假手术组兔予普通饲料，模型组、药物组兔予以高脂喂饲(胆固醇1.0﹪，猪油10﹪，余为普通饲料)。饲养2周后模型组、药物组兔行髂动脉内膜剥脱术，假手术组兔行假手术。术后模型组及药物组继续给予高脂喂饲，药物组同时加加味BHD，术后四周处死各组实验兔，留取血清检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、SOD、丙二醛(MDA)、TGF-β1、NO、NOS水平；剪取球囊损伤侧髂动脉，经中性甲醛固定后分别行HE染色观察血管内膜增生情况，通过免疫组化检查观察TGFβ-1和eNOS蛋白在血管壁的表达，图像分析仪分析染色结果；留取部分髂动脉通过透射电镜观察髂动脉的超微结构的变化，扫描电镜观察EC排列和结构；留取部分髂动脉采用RT-PCR方法检测血管壁TGF-β1和eNOS mRNA的表达。所有计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组均数比较采用单因素方差分析，再行组问Student-Newman-Keuls检验多重比较。P<0.05表示差别有统计学意义，应用SPSS11.0统计分析软件对实验数据进行统计分析。 结果： 假手术组兔于喂养两周时自然死亡1只，模型组兔于术后第10天死亡1只，药物组兔于术后第4天死亡1只。所以，每组各有7只动物进行到实验终点。 1、加味BHD对兔髂动脉形态学的影响： 光镜发现假手术组兔髂动脉管壁光滑，管腔和管壁厚度正常；模型组管壁和内膜明显增厚、管腔明显狭窄，可见巨大动脉硬化斑块；而药物组管壁及内膜增厚较轻，管腔狭窄较轻。图象分析结果示模型组兔髂动脉内膜面积明显大于药物组和假手术组(P<0.05)，而管腔面积明显小于药物组和假手术组(P<0.05)。 扫描电镜结果发现假手术组兔髂动脉内膜的EC形态正常，排列规整；而模型组兔髂动脉可见多处EC脱落，EC增生参次不齐，内皮下胶原纤维暴露：药物组EC排列则基本正常； 透射电镜发现假手术组兔髂动脉血管壁结构层次清晰，内皮完整，无泡沫细胞；模型组可见EC脱落，大量泡沫细胞及合成表型的VSMC游走；药物组EC则基本正常，泡沫细胞和VSMC较少； 2、加味BHD对兔血清脂质的影响： 药物组兔血清TC、TG和LDL-C明显高于假手术组，但是低于模型组，而且HDL-C明显高于假于术组和模型组，以上结果差别均有统计学意义(P<0.05)。 3、加味BHD对兔血清SOD活性和MDA水平的影响： 假手术组兔血清SOD活性明显高于模型组和药物组，药物组SOD活性又明显高于模型组(P<0.05)，假手术组兔血清MDA水平明显低于药物组和模型组，药物组MDA水平又明显低于模型组(P<0.05)。 4、加味BHD对兔TGF-β1的影响： 假手术兔血清TGF-β1含量明显低于模型组和药物组，药物组又明显低于模型组(P<0.05)。免疫组化结果显示假手术组兔髂动脉内膜TGF-β1的表达微弱，模型组TGF β-1的染色面积明显大于假手术组和药物组(P<0.05)及TGF-β1的染色灰度均明显大于假手术组和药物组(P<0.05)。RT-PCR结果显示假手术组兔髂动脉仪有少量TGF-β1 mRNA表达，而模型组TGF-β1 mRNA表达明显增加，药物组TGF-β1 mRNA表达较模型组则明显减少(P<0.05)。 5、加味BHD对兔NO系统的影响： 模型组兔血清NO水平和总NOS活性均明显低于假手术组和药物组(P<0.05)，而后两者之间差别无统计学意义(P>0.05)；免疫组化结果显示各组动物内膜均有eNOS蛋白表达，模型组和药物组eNOS蛋白表达较假手术组明显减弱(P<0.05)，而药物组eNOS蛋白表达较模型组明显增强(P<0.05)；RT-PCR结果显示各组动物内膜内均有eNOS mRNA表达，模型组和药物组eNOS mRNA表达较假手术组明显减弱(P<0.05)，而药物组较模型组明显增强(P<0.05)。 结论： 1.加味BHD可减轻兔髂动脉球囊损伤后的内膜增生和管腔狭窄。 2.加味BHD对高脂喂饲兔具有抗实验性As作用。 3.加味BHD可降低髂动脉球囊损伤后兔的血清TC、TG、LDL-C含量及升高血清HDL-C的水平，具有调节血脂的作用。 4.加味BHD可降低髂动脉球囊损伤后兔血清MDA的水平及增强SOD的活性，具有抗氧化应激的作用。 5.加味BHD可抑制髂动脉球囊损伤后内膜TGF-β1 mRNA及蛋白的表达，减少血清TGF-β1的产生。 6．加味BHD可促进髂动脉球囊损伤后内膜eNOS mRNA及蛋白的表达，增加血清总NOS活性及NO的产生。

目录

文摘

英文文摘

第1章前言

第2章材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3统计学分析

第3章结果

3.1病理组织学检查结果

3.2扫描电镜结果

3.3透射电镜结果

3.4加味补阳还五汤对兔血脂的影响

3.5加味补阳还五汤对兔血清SOD和MDA的影响

3.6加味补阳还五汤对兔TGF-β1的影响

3.7加味补阳还五汤对兔NO系统的影响

第4章讨论

第5章结论

参考文献

缩略词中英文对照

附录一硕士在读期间参与发表论文

附录二奖励证书

致谢

原创性声明