皮肤源祖细胞对去神经皮肤创面愈合作用的研究

摘要

截瘫病人引起的褥疮和糖尿病外周神经病变所致糖尿病足是临床上最常见的慢性创面。近年来，机体组织创伤伴所支配神经受损的慢性创面发生率呈上升趋势，而对于慢性创面的愈合机制和治疗一直是医学界有待解决的问题。目前关于创面愈合机制的研究很多，但是关于去神经支配的慢性创面愈合的机制鲜有报道。有研究表明，在创面修复过程中，皮肤神经的再生是重要的环节，但神经损伤是否对创面愈合有影响却莫衷一是。 皮肤源祖细胞 (skin-derived precursors，SKPS) 是一类分布于表皮基底层和毛囊隆突部的干细胞，具有神经元干细胞的特性。国外有学者根据SKPs能够在体外分化成为神经元和神经胶质细胞的特性，将其应用于中枢神经系统神经修复的实验研究，结果表明SKPs可重塑损伤的神经髓鞘。这为SKPs在神经系统疾病的细胞治疗方面带来了广阔的前景。 在此基础上，本次课题通过将培养的皮肤源祖细胞应用于去神经创面治疗，以观察皮肤源祖细胞对去神经创面细胞增殖活性、血管和神经再生的情况。 第一部分皮肤源祖细胞体外诱导神经元样细胞的实验研究 目的探讨皮肤源祖细胞的体外培养、鉴定及定向诱导成神经元的方法，为治疗神经系统疾病提供理想的种子细胞。方法取出生1～3d的昆明鼠皮肤，分离培养出皮肤源祖细胞；皮肤源祖细胞以含bFGF和10％FBS的培养基中预诱导24h，再以含DMSO和BHA的培养基中诱导7d；观察诱导细胞形态，免疫荧光鉴定细胞表达NF、NSE和GFAP情况；ELISA检测诱导细胞分泌NGF和BDNF情况。结果细胞诱导后呈多极性生长；细胞免疫荧光表达NF和NSE，GFAP表达阴性；随诱导时间延长培养液中BDNF和NGF浓度增加。结论皮肤源祖细胞在特定条件下能定向分化为神经元，并且能提高神经生长因子和脑源性神经营养因子的分泌，能为组织工程皮肤和修复神经系统病变提供种子细胞。 第二部分去神经支配对大鼠创面愈合的影响目的通过制备去神经支配大鼠创面模型，观察去神经大鼠创面愈合率、创面血管和皮肤增殖改变情况，为去神经创面愈合机制提供理论依据。方法分离并切断SD大鼠胸9～腰1右侧脊神经，造模后在背部对称制作两个直径为1.0cm的圆形创面，分别观察两侧创面愈合时间、创面大体和组织形态学、创面细胞增殖活性、创面修复过程中血管再生情况，并对数据进行统计分析。结果实验组愈合时间在4w，对照组为 3w；实验组创面上皮化速度慢于对照组；实验组愈合表皮层较薄，上皮细胞大小不一；愈合时真皮和表皮层细胞增殖活跃，2～4w时实验组增殖活性低于对照组 (p<0.05)；创面微血管主要分布于真皮层，密度随愈合时间增加，但2～4w实验组表现较实验组弱 (p<0.05)。结论去神经后皮肤创面细胞增殖低下，愈合时间延长，血管再生现象受到抑制。 第三部分皮肤源祖细胞对去神经皮肤创面愈合的作用目的通过将皮肤源祖细胞应用于裸鼠失神经支配创面，探索组织修复创面愈合的机制，同时为去神经创面的治疗提供新的实践依据和思路。方法 30 只裸鼠制作双侧去神经模型后，在失神经区域制作直径大小为0.5cm的圆形创面，第 3 代昆明鼠皮肤源祖细胞四点注射至创面，治疗后1w、2w和3w留取创面组织标本，对创面愈合率、创面细胞增殖活性、血管和神经再生进行检测。结果实验组上皮化速度明显较对照组加快，表皮层细胞较厚，2w时实验组创面完全愈合，对照组愈合时间为3w，愈合后创面收缩较实验组明显；愈合过程中创面细胞增殖活跃，3w时增殖现象减弱，各时间点增殖活性实验组明显强于对照组； 神经再生主要位于真皮层小血管附近，可见串珠状或波纹状弯曲的细小神经分支，实验组表达高于对照组；新生血管丰要位于真皮层，实验组血管密度大，且较大管腔形成。结论皮肤源祖细胞能够促进去神经皮肤创面愈合，提高皮肤细胞增殖活性，促进皮肤神经和血管再生，有利于去神经创面的修复。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

前言

第一部分皮肤源祖细胞体外诱导神经元样细胞的实验研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

第二部分去神经支配大鼠创面愈合的实验研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

第三部分皮肤源祖细胞对去神经皮肤创面愈合的作用

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

全文总结

问题与展望

参考文献

附图

致谢