双向免疫调节协同抑制移植后肝癌生长的实验研究

摘要

影响肝癌肝移植疗效的最大障碍就是术后肿瘤的转移和复发。临床和实验研究已证实,肝移植术后免疫疫抑制剂的应用抑制了机体的免疫系统,是肝癌复发和转移的一个不容忽视的因素。最近的研究显示,移植术后免疫抑制剂应用的剂量、肿瘤的分期与术后第一年内肿瘤复发息息相关。 FK506是通过与特异性胞浆神经亲免素12(FKBP12)发生作用而抑制T细胞的钙依赖性信号通路,抑制神经钙蛋白活性,从而达到抑制T细胞增殖目的。此外,FK506亦被证实可抑制IL-2作用及其它促生长素cytokines的产生,另具有抑制混合淋巴细胞反应、细胞毒性T细胞的增殖、B细胞的激活等主要作用。 胸腺肽(Ta1,日达仙注射液,thymosina 1)1966年由Goldstein首先从小牛胸腺中提取并命名,人们对其进行了大量研究。结果表明:Ta1可以促进淋巴细胞的转化,增强巨噬细胞的吞噬活性,对机体免疫机能既具有增强作用又有抑制作用,是一种高效的双向免疫调节剂。 本研究试图将Ta1+FK506联合应用,既发挥其抑制作用来协助移植后免疫耐受的维持,同时又充分发挥其在体液免疫、自然杀伤中的强力作用,达到术后抗肿瘤的根本目的。 第一部分：异位大鼠心脏移植模型的建立。 目的：复制改良大鼠腹腔/颈部异位心脏移植模型并观察其排斥反应。 方法：健康远交系SD大鼠为供体,Wistar大鼠为受体,将供心移植于受体的腹腔内,供心的升主动脉及右肺动脉分别与受体的腹主动脉和下腔静脉做端侧吻合；供心移植于受体的颈部,则供心主动脉与受体颈总动脉行端侧吻合,供心肺动脉断端与右颈外静脉行端端吻合,术后第3、5、7天各取2例移植心脏行组织学检查。 结果：腹腔异位心脏移植组手术与颈部异位心脏移植组手术,两种术式的手术成功率无显著差别(x2=1.0714,P=0.3006);同系移植组移植心长期(>40天)存活,同种异系移植组移植心平均存活时间为7.6d±1.9d,两组存在差异显著(P<0.01);HE染色提示同种异系大鼠移植后5-7天出现急性排斥反应改变。 结论：稳定建立大鼠异位心脏移植模型可为研究器官移植后免疫状态提供良好工作平台。 第二部分：Tα1联合FK506应用对大鼠移植后免疫耐受状态的影响。 目的：在大鼠心脏移植模型基础上,尝试将Tα1联合FK506应用于受体大鼠,观察免疫调节剂Tα1对移植后免疫耐受状态的影响,并进一步探讨其可能机制。 方法:FK506与不同剂量Tα1联合应用,筛选出不引起急性排斥的最大Tα1用药剂量；设立CONTROL组、FK506组、FK506+Tα1组,分离外周血T细胞,进行单向混合淋巴细胞反应试验(MLR),外源IL2对耐受大鼠外周血淋巴细胞MLR的影响测定,外周血白细胞计数,移植心细胞因子mRNA RT-PCR检测,流式细胞仪分析外周血T细胞CD25+淋巴细胞,以及CD4+T细胞中CD25+表达检测。 结果：我们获得不引起急性排斥的最大Tα1联合用药剂量为320μg/kg:FK506+Tα1联合应用组对SD/Wistar大鼠淋巴细胞作为刺激细胞的混合淋巴细胞反应特异性降低,外源性IL-2的加入并没有使耐受大鼠外周血中淋巴细胞MLR降低作用改善；FK506+Tα1联会应用后,外周白细胞数逐日升高,术后6-7天达到峰值；联合实验组中形成耐受的大鼠IL-4和IL-10明显高于对照组,而IL-2和IFN-γ则明显低于对照组(P<0.01);CD4+T细胞中CD25+细胞在流式细胞仪检测结果显示实验组(M1 27.2±13.4)较对照组(M1 7.4±1.4)明显增加(P<0.01)。 结论：单用Tα1确实具有一定免疫增强作用,可增加移植术后排斥发生的风险；Tα1联合FKS06(320μg/kg)在术后第6日未引起移植心急排发生或存活率的改变；MLR反应从体外证实:K506+Tα1(320μg/kg的联合应用确实诱导出与单用FK506类似的移植后免疫耐受状态,且这种状态在体外并不能被外源性IL-2所逆转,是一种稳定的耐受；细胞因子mRNA RT-PCR检测结果提示,细胞因子偏向Th2亚类可能是K506+Tα1(320μg/kg)联合应诱导大鼠形成移植免疫耐受机制之一,Tα1的介入似乎是通过周围型克隆清除和部分克隆无能混合途径共同发挥其免疫抑制(躲避)作用,其具体作用靶点可能为CD4+CD25+Treg细胞。 第三部分：Tα1应用对大鼠移植后肝癌发生的生物学观察。 目的：在实验一、二建立的Tα1+FK506联合应用形成稳定移植后耐受状态的大鼠心脏移植模型基础上,通过荷瘤实验进一步研究Tα1应用后其抗肿瘤作用的发生及其可能机制。 方法：荷瘤大鼠模型的建立；荷瘤移植鼠成瘤潜伏期和存活期观察；外周血清与大鼠肝癌细胞系混合培养细胞凋亡率检测(MTT法)及肝癌细胞凋亡电镜观察；大鼠自体CTL对肝癌细胞的杀伤作用；脾细胞中CD16/CD56(NK细胞)表达变化(FCM分析)。 结果:FK506+Ta1联合应用组与control组相比,无论是成瘤潜伏期还是荷瘤大鼠存活时间均明显延长(P<0.05);FK506单独作用时,可明显抑制荷瘤大鼠CBRH-7919体外凋亡,FK506+Ta1联合应用组则凋亡刺激指数SI(197±5.2％)明显升高,大于空白对照组(P<0.01),透射电镜下凋亡小体出现；三组CTLs对CBRH-7919的杀伤率表明FK506应用后降低大鼠脾T细胞对于肿瘤细胞的杀伤活性,而FK506+Ta1联合应用同样出现细胞毒性作用降低(19.44±5.31％),与control组(36.12±8.71％)相比具有显著性差异(P<0.05),但与FK506组(18.36±3.12％)比较,CTL作用则无明显改变；流式细胞仪检测显示FK506+Tα1组受体脾细胞中CD16+CD56+T(NK细胞)细胞的含量明显高于对照组(17.9±7.6％ vs.3.9±1.2％,P<0.01)。 结论：荷瘤移植鼠成瘤潜伏期和存活期观察提示Tα1确实具有抗肝癌作用；联合应用组外周血清与肝癌细胞CBRH-7919的混合培养明显具有杀肿瘤作用,透射电发生镜也证实了肝癌细胞凋亡的发生；各组自体CTLs对肝癌细胞的杀伤效应(细胞毒性杀伤作用)无明显差异提示其抗肿瘤机制并非由细胞免疫主导,NK细胞的增加在此时可能发挥更为重要的作用。 总结：1.大鼠异位心脏移植模型可为研究器官移植后免疫状态提供良好工作平台。2.K506+Tα1(320μg/kg)联合应用在大鼠可诱导出稳定的移植后免疫耐受状态,似乎是通过周围型克隆清除和部分克隆无能混合途径共同发挥作用,其具体作用靶点可能为CD4+CD25+Treg细胞。3.Tα1确实具有抗肝癌作用,在移植后免疫耐受状态下,刺激NK细胞的增加是其发挥作用的可能途径。

目录

论文说明：英文缩略语表

前言

第一部分异位大鼠心脏移植模型的建立

1.材料与方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

附图1

附图2

第二部分 Tα1联合FK506应用对大鼠移植后免疫耐受状态的影响

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

第三部分 Tα1应用对大鼠移植后肝癌发生的生物学观察

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

全文总结

附件

致谢