IFN-Lambda3协同索拉非尼对肝癌细胞体外增殖及裸鼠肝癌移植瘤生长抑制的实验研究

摘要

目的：
　　索拉非尼广谱的分子激酶抑制效用提示能够与抗病毒作用药物的新型细胞因子IFN-Lambda3联合加强对肝细胞型肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）治疗的临床获益，在这里，我们首次评价联同使用IFN-Lambda3作为索拉非尼在HCC的辅助治疗。在第一部分研究中，我们旨尝试在通过人肝癌细胞株的体外水平展开实验研究，观察两种药物的联合用药模式，是否具有对人肝癌细胞株存在协同的增殖抑制作用及激发细胞凋亡途径的开始，并初步探讨其可能的潜在的相关机制；同时为了更好的探究两种药物制剂的联合用药模式是否具有潜在的抗肝脏恶性肿瘤的效果与临床实践应用的价值。在第二部分研究中，我们选择应用之前体外实验筛选出的IFN-Lambda受体复合物表达阳性的人肝癌细胞株，建立免疫缺陷裸鼠异种移植肿瘤模型，观察联合两种药物制剂对裸鼠皮下肝癌移植瘤生长的影响，以此进行最终评价。
　　方法：
　　（1）离体细胞培养人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、SK-HEP-1、BEL-7402与正常人肝脏细胞株L-02，并取材HCC手术患者人体肝癌组织新鲜标本，实时定量-PCR筛选检测特异性IFN-Lambda受体复合物（IL-28R1和IL-10R2）的基因表达水平，确定阳性表达IL-28R1和IL-10R2 mRNA的细胞株，从中选择两种人肝癌细胞株作为靶细胞，进行后续平行独立实验；
　　（2）常规培养上述实验确定的两株细胞，采用索拉非尼和/或IFN-Lambda3作为体外细胞干预药物，实验分组如下：1）对照组：正常条件下培养人肝癌细胞株；2）IFN-Lambda3处理组：培养人肝癌细胞株，添加10ng/mL的药物处理细胞；3）Sorafenib处理组：培养人肝癌细胞株，添加3μmol/L的药物处理细胞；4）IFN-Lambda3+Sorafenib联合处理组：培养人肝癌细胞株，添加10ng/mL的IFN-Lambda3和3μmol/L的索拉非尼处理细胞。上述选择的两株细胞，分别培养24小时与48小时后收集细胞，CCK-8检测细胞的存活率、平板克隆试验检测细胞的群体依赖性与克隆增殖形成能力；
　　（3）24小时与48小时后，流式细胞仪检测观察两种人肝癌细胞株四个分组药物干预后的细胞周期以及细胞凋亡的变化、细胞线粒体膜电位改变以及细胞内活性氧簇物质的释放情况；
　　（4）48小时后收集细胞，蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测两种人肝癌细胞株四个分组细胞内的p21、cyclin D1和cleaved-caspase-3蛋白质水平的表达情况；
　　（5）采取体外实验筛选出的 IFN-Lambda受体复合物表达阳性的人肝癌细胞株SMMC-7721，选择对数期生长状态较好的细胞建立裸鼠皮下移植瘤动物模型，根据药物干预方式的不同持续治疗四周，将16只裸鼠分为如下四组：1）对照组：给予2ml/kg生理盐水处理；2）IFN-Lambda3处理组：给予0.1mg/kg的药物处理；3）Sorafenib处理组：给予5mg/kg的药物处理；4）IFN-Lambda3+Sorafenib联合处理组：给予0.1mg/kg的IFN-Lambda3和5mg/kg的索拉非尼处理；
　　（6）监测成瘤裸鼠在IFN-Lambda3和/或索拉非尼干预下一般情况及移植瘤体积大小；实验四周期结束后采用病理学技术苏木素-伊红及免疫组织化学染色法，镜下检测裸鼠移植瘤组织中肿瘤细胞的病理形态和增殖蛋白Ki-67的表达改变，并进一步TUNEL染色观察诱导凋亡细胞个数。
　　结果：
　　人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721及BEL-7402和取材HCC手术患者的肝癌组织标本，都在基因水平存在IFN-Lambda受体复合物（IL-28R1和IL-10R2） mRNA的表达，但是SK-HEP-1细胞株表达为阴性；CCK-8和平板克隆试验表明索拉非尼和IFN-Lambda3协同抑制人肝癌细胞株（HepG2和SMMC-7721）体外生长增殖；流式细胞仪检测显示索拉非尼和IFN-Lambda3协同激发细胞凋亡并阻滞分裂间期 G0/G1期，而且可以促进细胞线粒体膜电位的损失和细胞内活性氧簇物质的释放；蛋白质水平表现为增加p21的表达和触发cleaved-caspase-3的活性，并且抑制cyclin D1的表达。在体内裸鼠实验模型治疗四周后，对照组肿瘤体积大小显现为递增生长的趋势，余3个药物处理组肿瘤生长均现抑制效应。从中发现对裸鼠两种药物单独干预可减小移植瘤体积， IFN-Lambda3+Sorafenib联合处理组对移植瘤体积大小的改变最明显，与对照组比较差异具有极显著的统计学意义（p<0.01），同时与IFN-Lambda3单药组和Sorafenib单药组相比差异具有统计学意义（p<0.05）；此外，免疫组化技术分析切除的移植瘤组织中Ki-67蛋白表达水平表明，3个药物处理组中的裸鼠形成的皮下移植瘤与对照组相比显示出较低的Ki-67阳性增殖率，而IFN-Lambda3+ Sorafenib联合处理组中的裸鼠移植瘤组织内表现出最低的Ki-67阳性增殖率，差异具有统计学意义（p<0.05）；TUNEL染色检测切除的移植瘤组织中的细胞凋亡数目，与对照组相比，3个药物处理组中的裸鼠在其皮下移植瘤中显示出较高的细胞凋亡率，其中IFN-Lambda3+Sorafenib联合处理组中出现最高的凋亡率，差异具有统计学意义（p<0.05）。
　　结论：
　　索拉非尼与 IFN-Lambda3能够在体外细胞水平联合作用于人肝癌细胞株（HepG2和SMMC-7721）表现出协同效应，其机制可能是抑制细胞增殖生长与激发细胞凋亡途径的开始，使细胞分裂间期 G0/G1期停滞，促进线粒体膜电位的损失和诱导细胞内活性氧簇物质的产生释放，并且影响细胞周期相关调控蛋白（p21与cyclin D1）和凋亡蛋白（cleaved-caspase-3）的表达水平；同时两种药物制剂显著抑制裸鼠体内人肝癌细胞株SMMC-7721皮下移植瘤的生长，具有协同作用，并与抑制皮下移植瘤的细胞增殖和诱发凋亡有关，证实二者联合用药模式可以在体内水平治疗HCC。

目录

声明

第一部分 引 言

1.1 肝癌的流行病学概况

1.2 肝癌诊疗的研究进展

1.3 多分子靶向药物的肝癌治疗

1.4 基于抗病毒药物的细胞因子肝癌治疗新策略

第二部分 IFN-Lambda 3协同索拉非尼对人肝癌细胞株的体外抑制作用研究

2.1研究背景

2.2 材料和方法

2.3 实验结果：

2.4 实验小结：

第三部分 IFN-Lambda 3联合索拉非尼对裸鼠肝癌移植瘤生长影响的实验研究

3.1 研究背景

3.2 材料和方法

3.3 实验结果

3.4 实验小结

第四部分 讨 论

第五部分 结 论

5.1 主要结论

参考文献

中英文缩略名词索引

在学期间的研究成果

致谢

附录