米诺环素对硝普钠诱导的大鼠海马神经元凋亡的抑制作用

摘要

一、研究背景 海马是大脑边缘系统的重要组成部分。在功能和纤维联系上，不仅与嗅觉有关，更与学习记忆、内脏活动、情绪反应、性活动、内分泌以及生物节律的调节密切相关[1][2]。随着科学研究手段的不断进步，海马结构的异常，尤其是海马神经元凋亡被发现是构成许多严重疾病的一种重要病理基础。 研究发现，中枢神经系统退行性疾病，如老年性痴呆(Alzheimer disease，AD)，其特征性的病理变化之一是脑内神经元(尤其基底前脑和海马区)数目明显减少。而细胞凋亡活动过盛可能是其渐进性神经退变的重要原因之一；大鼠血管性痴呆(vascular dementia，VD)模型中海马CA1、CA3区的神经细胞凋亡率随时间延长逐渐增加，海马区Caspase-3、NMDAR1-mRNA的表达显著改变，被认为是导致认知障碍的一种重要病理学基础瞄；海马硬化是颞叶癫痫最常见的一类病理类型，其主要表现为神经元脱失和胶质细胞增生。癫痫发作后24 h，海马CA3和CA4区出现大量凋亡神经元。目前许多研究认为，神经元凋亡既是导致海马硬化，癫痫频发、难治以及致残的原因，又是癫痫发作的结果。但到目前为止，这些以海马神经元凋亡为重要病理基础的严重疾病均尚无特别有效的治疗方案。要能寻找到一种既能有效抑制海马神经元凋亡，又易透过血脑屏障的药物，无疑给这些人类治疗棘手的疾病带来新的希望。 米诺环素(minocycline)作为第二代半合成的四环类广谱抗生素，在临床上已经应用了近40年。从1994年开始，Clark及Koistinaho等相继发现米诺环素对兔和鼠的脑缺血模型具有神经保护作用，之后米诺环素在中枢神经系统的作用逐渐被引起重视。大量研究表明，米诺环素在诸如：脑缺氧、亨停顿病、肌萎缩侧索硬化、帕金森氏病、多发性硬化、脑外伤、癫痫、精神分裂症、脊髓损伤等许多神经系统疾病的体内、外动物模型中都显示出明显的神经保护效应。尤其对细胞凋亡抑制作用显著。同时米诺环素具有高亲脂性，极易通过血脑屏障，口服胃肠道吸收好，长期使用人体耐受性好，副作用小等独特优点。 基于以上理论基础及研究成果，我们设计了该课题，研究米诺环素对体外培养的海马神经元凋亡是否有抑制作用?旨在为AD、VD、颞叶癫痫等各种以海马神经元凋亡为病理基础的疾病探索可能的新防治方案。 二、研究目的 1.体外分离培养大鼠海马神经元细胞，并用硝普钠诱导其凋亡，构建体外神经细胞的凋亡模型。 2.明确米诺环素是否对海马神经元凋亡具有抑制作用。 3.明确该种抑制作用是否具有剂量依赖性。 4.明确该种抑制作用是否具有超早期和迟发效应之分。 5.若有抑制作用，进一步讨论米诺环素对海马神经元凋亡产生抑制作用的可能机制。 三、实验对象及方法 (一)实验对象出生1—3天的SD大鼠脑。 (二)实验方法 1.四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测： ①细胞分组：将培养7天的原代海马神经元细胞随机分为4组：1)正常组：除了细胞培养液未进行任何药物干预；2)单纯SNP组：更换细胞培养液后，加用硝普钠作用24h；3)单纯Mino组：更换细胞培养液后，各自用不同浓度0.002、0.02、0.2、2、20umol／L的米诺环素单独处理细胞24h。4)SNP+Mino组：在3)组的基础上更换细胞培养液，再用硝普钠作用24h。 ②处理：按上述细胞分组处理细胞后，每类样本设6孔，每孔加MTT溶液(5 g／L)20 μl，37℃孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μl二甲亚砜(DMSO)，振荡15min，至晶体颗粒溶解，在酶标仪上测定595nm的吸光度，计算细胞存活率。 2.流式细胞仪检测细胞凋亡： ①细胞分组：将原代培养7天的海马神经元随机分4组：1)正常组：除了细胞培养液未进行任何药物干预；分别于3天和7天时观察结果；2)对照组(单纯硝普钠组)：先加入凋亡诱导剂硝普钠处理24 h，然后更换正常培养基，分别于3天和7天观察结果。3)预防组：先加入不同浓度的米诺环素注射液作用后，细胞分2批，分别于3天和7天时，再加用硝普钠干预细胞24h；4)治疗组：加用硝普钠作用细胞24h，诱导神经元凋亡，再细胞分2批，分别加入不同浓度的米诺环素注射液作用3、7天。 (米诺环素分别用0.002、0.02、0.2、2umol／L的浓度进行干预)。 ②处理：按照上述分组处理细胞后，PBS漂洗，然后用O．125％胰蛋白酶消化贴壁细胞，接着低速离心(500 r／min，10 min)后，加入Annexin V—FITC和PI染液重悬细胞，室温避光温育10分钟，HEPES洗涤后过滤上机检测，分析结果。 3.Tunel检测细胞凋亡 按照上述2①同样的分组方案处理细胞后，弃培养液，用4％多聚甲醛固定细胞，接着按照Tunel试剂盒的说明进行操作。染色后在显微镜下观察：计算凋亡指数。 四、实验结果 1.MTT检测米诺环素产生细胞毒性的浓度滴定 ①米诺环素在0.002～2umol／L浓度范围时，对细胞活性无明显毒性。②达到20umol／L时，米诺环素具有细胞毒性，细胞活性仅43.229％±4.075％。③用0.002～2umol／L米诺环素分别预处理细胞后，再用硝普钠作用细胞，细胞活性随着米诺环素预处理浓度的升高而升高，存在量效关系，比单纯SNP组的细胞活性明显增加，但仍低于正常组细胞活性。 2.流式细胞仪检测凋亡 ①预防组和治疗组的细胞凋亡率介于相同时间点正常组与对照组的细胞凋亡率之间；且米诺环素浓度为0.2umol／L时的细胞凋亡率，最低。②治疗组细胞凋亡率比预防组的明显降低。③各组3天点细胞凋亡率明显低于7天点的值。 3.Tunel从形态上检测神经元凋亡情况正常组未见TUNEL阳性细胞，对照组TUNEL阳性细胞基本上布满整个视野。和正常组统计学差异显著(p<0.05)。 米诺环素干预后，预防组和治疗组的TUNEL阳性神经元数量介于相同时间点的正常组和对照组之间；且在米诺环素采用0.2umol／L时，阳性神经元数量最少。与硝普钠组比较，P<0.05： 五、实验结论 1.对体外培养的海马神经元细胞，米诺环素为0.002～2umol／L时，米诺环素浓度与神经元活性存在量效关系。且对细胞无明显毒性。 2.米诺环素对硝普钠体外诱导的海马神经元凋亡具有抑制作用。该种抑制作用在米诺环素浓度为0.2umol／L时表现的最明显。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

研究目的

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

附录

致谢